Нуклеиновые кислоты в центре внимания
Развитие РНК-терапии было бы немыслимо без крупных открытий фундаментальной молекулярной биологии. В 1869 году швейцарский физиолог Фридрих Мишер обнаружил новую молекулу, открытие которой знаменовало начало новой эпохи — «века ДНК». В то время этот молодой еще ученый задался целью изучать «внутренний мир» клетки, прицельно сосредоточившись на ее химическом составе. Для исследований он использовал белые кровяные клетки, известные как лейкоциты. Эти маленькие защитники нашего организма особенно активно борются с инфекцией, поглощая различные патогены и скапливаясь в больших количествах там, где начинается воспаление. Чтобы набрать необходимое для анализа количество клеток, Мишер обращался за помощью к местным хирургам. Те регулярно приносили ученому свежеиспользованные бинты, пропитанные гноем пациентов — именно в этом необычном материале таились тысячи лейкоцитов, готовых делиться своими секретами.
Для начала Мишеру пришлось разработать методы промывания лейкоцитов и отделения цитоплазмы от ядер. В попытках анализировать выделенные из этих клеток белки и липиды, исследователь обнаружил вещество с неожиданными свойствами: при небольшом подкислении оно выпадало в осадок в виде белых нитей или хлопьев, но стоило добавить щелочь — вновь растворялось. Загадочная субстанция была названа «нуклеином», и Мишер тогда и не ведал, что впервые выделил ДНК.
В последующем открытие двойной спирали ДНК Уотсоном и Криком (а это произошло больше чем через 80 лет после опытов Мишера) и формулирование центральной догмы молекулярной биологии установило матричную и линейную природу передачи информации в клетке: от ДНК к РНК и далее к белку. Такое уже вполне современное представление стало возможным лишь благодаря определению структур и функций нуклеиновых кислот, причем далеко не последнюю роль здесь сыграло изучение молекул РНК.
РНК на авансцене: первое приближение
Итак, открытие и исследование нуклеиновых кислот показало их важность для всех жизненных процессов (таких как рост, развитие и размножение); обнаружение же в 1961 году мРНК подчеркнуло особую значимость именно этой молекулы как ключевого посредника в передаче генетической информации.
Однако было и другое не менее важное (но менее обсуждавшееся) открытие, имевшее решающее значение для всей области РНК-терапии (и не только): а именно обнаружение того, что две РНК могут образовывать пары оснований друг с другом. Хотя сейчас уже это воспринимается как нечто само собой разумеющееся, раньше исследователи не верили, что РНК может образовывать двойную спираль. В 1956 году американские биологи Александр Рич и Дэвид Р. Дэвис убедительно продемонстрировали такую возможность. Смешивая натриевые соли полиадениловой и полиуридиловой кислот, они с удивлением обнаружили, что получаемый раствор становится вязким. Анализируя под рентгеновскими лучами полученное «желе», они отметили, что структура была характерной для спирали, и больше того — демонстрировала поразительное сходство с ДНК. Новость об этом вызвала вполне ожидаемый скепсис среди коллег-биохимиков: «Без фермента?!» — с сомнением спросил один из них, не веря в такой результат. Дело в том, что в 1950-е соединение двух сложных биополимеров без участия ферментов-катализаторов считалось невозможным.
Тем не менее, вскоре стало ясно, что Рич и Дэвис совершили настоящий прорыв, впервые зафиксировав гибридизацию, — явление, метко окрещенное Джулианом Хаксли «молекулярным сексом». Гибридизация стала основой совершенно нового подхода к взаимодействию нуклеиновых кислот и открыла двери множеству важнейших технологий молекулярной биологии: от ДНК-микрочипов и антисенс-терапии (про нее ниже) до самых продвинутых технологий вроде CRISPR-Cas9. Сам факт образования пар ДНК–РНК сразу подсказывал: перенос генетической информации происходит именно в направлении между этими биополимерами — процесс, ныне известный как транскрипция.
То что ДНК может гибридизоваться с РНК, выявил экспериментально тот же Александр Рич. Смешивая молекулы синтетических ДНК и РНК, он увидел, что их взаимодействие дает комплекс, имеющий структуру двойной спирали. На этом основании он и предположил, что перенос генетической информации в живой клетке происходит как раз между этими двумя молекулами. Больше об изучении нуклеиновых кислот в статье: «Выделяем нуклеиновые кислоты: эволюция методов».
В 1978 году американские молекулярные биологи Пол Замечник и Мэри Стивенсон, опираясь на теперь уже всем известный феномен «молекулярного секса», показали, что такой вот «секс» способен (как это ни парадоксально!) прерывать размножение вирусов. Используя короткие нуклеотидные цепочки, они обнаружили, что при их связывании с последовательностями РНК-генома вируса саркомы Рауса происходит подавление его репликации. Стало понятно, что для свободного считывания информации смысловая нуклеиновая цепочка (то есть та, что несет в себе генетический «шифр») всегда должна быть «незанятой»; ну а если ранее с ней уже связалась какая-то комплементарная цепь (антисмысловая), дальнейшее копирование и передача генетической информации могут стать попросту невозможными.
Замечник такую технологию окрестил «антисмысловой», и спустя время она легла в основу создания препаратов-антисенсов для лечения самых разных заболеваний. В дальнейшем по мере изучения ключевых этапов биосинтеза стало ясно, что считыванием со смысловой геномной цепи транскрипция вовсе не ограничивается; образовавшиеся мРНК затем подвергаются «созреванию»: их некодирующие участки (интроны) вырезаются, после чего оставшиеся кодирующие последовательности (экзоны) — сшиваются. Этот важнейший процесс известен нам теперь как сплайсинг, и отклонения в нем могут стать причиной разнообразных генетических сбоев и соответствующих им заболеваний.
В начале 1990-х команда американского биохимика польского происхождения Збигнева Домински выяснила, что если нацеливать антисмысловые нуклеотиды на определенные сайты сплайсинга, можно не только подавлять экспрессию генов, но и напротив — восстанавливать их нормальную работу. Все эти непрекращающиеся исследования медленно, но верно подводили научную базу для создания современных антисенсов с самым разным механизмом действия.
Феномен РНК-интерференции
В 1998 году американские ученые Эндрю Файр и Крейг Мелло сообщили об обнаруженном ими эффекте подавления экспрессии генов (сайленсинга) у нематоды Caenorhabditis elegans при введении этому червю двухцепочечной РНК ─ открытие, которое они назвали РНК-интерференцией. Похожие явления наблюдали ранее у растений, но именно обнаружение сайленсинга у нематод позволило понять, как это работает. Постепенно стало ясно, что механизм подавления генов РНК-интерференцией ─ это эволюционно консервативный, естественный процесс. Ключевым моментом в его изучении стало открытие, что двухцепочечная РНК при введении в клетку расщепляется на более короткие РНК-фрагменты.
Эти малые интерферирующие РНК (siRNA) — короткие двухцепочечные молекулы, которые, связываясь с белковым комплексом, могут разрушать целевую мРНК, тем самым «выключая» экспрессию определенных генов. Этот процесс позже был обнаружен и у высших организмов, что показало универсальную роль механизма РНК-интерференции в регуляции генов.
Одним из ключевых событий стал эксперимент 2002 года, показавший, что siRNA может эффективно подавлять активность патогенных генов у мышей, что стало первым доказательством потенциального терапевтического применения этой технологии в живом организме. Это дало мощный импульс для дальнейшего развития идеи направленного блокирования генов .
За открытие механизмов РНК-интерференции Эндрю Файр и Крейг Мелло получили в 2006 году нобелевскую премию; а совсем недавно, в 2024 году американские ученые Виктор Эмброс и Гэри Равкун также стали нобелевскими лауреатами, но уже за «открытие микроРНК и ее роли в посттранскрипционной регуляции генов». МикроРНК ─ это молекулы, во многом схожие с siRNA; но вот только одноцепочечные, и в сравнении с siRNA они обладают более широким функционалом: воздействуя не только на РНК, но и на ДНК могут не только репрессировать, но и активировать экспрессию генов. Вообще, все это оказалось частью очень древних механизмов генной регуляции, о которой мы с каждым годом узнаем все больше, но пока еще очень далеки от раскрытия всех тайн. Подробнее об этом в статьях: «МикроРНК с огромным влиянием — за что вручили Нобелевскую премию по медицине (2024)» и «Обо всех РНК на свете, больших и малых».
Медленное развитие клинического применения: первые шаги
Так получилось, что препараты РНК поступили в терапевтическую практику далеко не сразу. Лишь спустя 20 лет после опытов Замечника, доказавших концепцию «антисмысла», Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) одобрило самый первый препарат ASO для клинического применения (в 1998-м году). Это лекарство — Фомивирсен — представляло собой искусственно синтезированную 21-нуклеотидную цепочку, связывающуюся с комплементарной последовательностью мРНК цитомегаловируса (CMV) и блокирующую трансляцию белков, необходимых для его репликации. Средство использовалось для лечения цитомегаловирусного ретинита — серьезной инфекции сетчатки, способной привести к слепоте пациентов, страдающих СПИДом. Несмотря на терапевтическую эффективность, препарат довольно быстро сняли с рынка из-за успеха антиретровирусной терапии (см.: «Связанные одной лентой»).
Тем не менее, Фомивирсен предоставил первое доказательство клинической ценности АSО; а кроме того, это еще и был первый успешный кейс в преодолении одной из главных проблем РНК-лекарств — их нестабильности. Дело в том, что если доставлять в организм просто «голую» (немодифицированную) РНК, она будет очень быстро элиминирована: ферменты-нуклеазы просто расщепят ее на составляющие, которые затем будут утилизированы. Для преодоления этой природной напасти требовалось каким-то образом «прикрыть» нуклеотидную цепочку от «враждебных» нуклеаз, и первым рабочим вариантом стала химическая модификация нуклеотидов, примененная в Фомивирсене. В «торчащих» из нуклеотидов остатках фосфорной кислоты заменяли кислород серой, что сразу делало всю молекулу более стабильной, значительно увеличивая период ее полувыведения (о других «рабочих» вариантах защиты от нуклеаз будет сказано ниже).
К сожалению, сказать, что после данного успеха одобрения новых РНК-лекарств посыпались как из рога изобилия, значило бы очень сильно слукавить: скорее все было наоборот. В течение почти двадцати последующих лет на рынке появилось лишь несколько таких препаратов, а сама область оставалась не у дел с точки зрения массового коммерческого успеха.
Лишь в 2016 году несомненный успех Спинразы для лечения спинальной мышечной атрофии (СМА) вызвал новый всплеск интереса к подобным разработкам . За ним последовал ряд важных достижений, включая одобрение в 2018 году препарата Патисирана (Onpattro) — первого лечения на основе siRNA редкого заболевания — транстиретиновой амилоидной полинейропатии (подробнее об этом ниже). Параллельно с этими событиями ученые разрабатывали и другие варианты РНК-лекарств.
Дело в том, что этот препарат, в отличие от многих других антисенсов, оказался по-настоящему эффективным, причем от неизлечимой болезни с весьма и весьма печальным прогнозом. Поспорить в эффективности с ним смогла классическая генозаместительная терапия, а именно — препарат Золгенсма, также оказавшийся одним из самых эффективных в своем классе. Про оба этих лекарства мы писали уже не раз и не два: «Самое дорогостоящее лекарство в мире», «СМА: три буквы — три лекарства», «Есть ли смысл в антисенсах?», «Надежда для СМАйликов» , «Генная терапия нейромоторных болезней».
Первоначально мРНК-вакцины создавались для борьбы с гриппом, затем с раком; но здесь быстрого успеха достичь не удалось (новейшие разработки в этой области будут рассмотрены ниже). А вот по-настоящему «выстрелить» получилось только во время пандемии COVID-19, когда гонки за созданием эффективных вакцин настолько подстегнули разработку лекарств (да и всю фармацевтику), что наконец-то позволили вывести на рынок этот новый терапевтический подход. Первыми коммерчески успешными мРНК-вакцинами против ковида стали препараты от Moderna и Pfizer/BioNTech .
Тогда они помогали бороться с SARS-CoV-2, для чего доставляли в клетки РНК-цепочки, кодирующие антигены его поверхности ─ спайк-белки. Иммунные клетки запоминали этих «чужаков», в результате при заражении ковидом они были во всеоружии: срабатывавший иммунитет обеспечивал отсутствие симптомов при заражении (или протекание болезни в более легкой форме). Про вакцины от COVID-19 мы рассказывали в статьях: «Гонка во спасение: безопасны ли вакцины против коронавируса?»; «Вакцины против коронавируса: перспективы»; «Спутник V», «ЭпиВакКорону», «Модерну» делать будем? Ликбез по вакцинам против коронавируса».
О текущем состоянии РНК-терапии, клинических испытаниях наиболее перспективных лекарств, а также о тех, что уже одобрены к применению, читайте на нашем сайте!