Функциональные продукты — это цельные, обогащённые или специально созданные продукты питания, которые помимо базовой пищевой ценности обладают дополнительными полезными свойствами. К ним относятся натуральные продукты, такие как ягоды, или специально модифицированные ингредиенты, например пробиотики.
Помимо основных питательных веществ, функциональные продукты содержат много биологически активных компонентов, полезных человеку. Они обладают антиоксидантными, нейропротекторными, гипогликемическими и уменьшающими содержание жира в крови свойствами.
К таким функциональным продуктам относится кофе. Арабика (Coffea arabica) и робуста (Coffea canephora) — самые распространённые виды кофейных деревьев. Дитерпеноиды представляют собой ключевые компоненты кофе, большинство из которых существуют в форме дитерпеновых эфиров жирных кислот. Известно около 24 видов кислот, формирующих эти эфиры, но основными выступают линолевая и пальмитиновая кислоты.
Содержание кофейных дитерпенов варьируется в зависимости от вида кофе. До сегодняшнего дня их зафиксировано более 70 типов. Некоторые из них, включая кафестол и кавеол, известны своими противораковыми и сахароснижающими свойствами, поэтому важно искать другие активные дитерпены и спектр методов их изоляции довольно широк.
Методы выявления биологически активных соединений
При извлечении функциональных ингредиентов из сложных пищевых экстрактов учёные сталкиваются с серьёзными трудностями. Традиционный фитохимический анализ включает несколько этапов: экстракцию, разделение, структурный анализ и оценку активности, что требует значительных усилий, занимает много времени и не всегда обеспечивает нужную точность результатов.
Но современные технологии, такие как ядерный магнитный резонанс (NMR), высокоэффективная жидкостная хроматография с твердофазной экстракцией и NMR-спектроскопией (HPLC-SPE-NMR), жидкостная хроматография-масс-спектрометрия высокого разрешения (LC-MSn) и масс-спектрометрия с мультиплексностью (MSn), позволяют значительно ускорить выявление биологической активности или проведение метаболомического анализа.
Методы NMR и LC-MSn используются для идентификации биодоступных соединений и оценки их свойств. Для отслеживания активных соединений применяется подход молекулярного сетевого анализа на основе LC-MS/MS. Использование комбинации технологий NMR и LC-MS/MS обещает стать эффективным инструментом обнаружения биоактивных молекул.
Исследование
В рамках данного исследования учёные сочетали методики NMR и LC-MS/MS для выявления новых дитерпенэфиров в обжаренных зернах арабики. Структуру вновь выявленных дитерпенов определили методом спектрального анализа. Цель состояла в минимизации хроматографического разделения, что позволило бы сократить использование растворителей и расходных материалов, сделав процесс экологичнее и экономичнее.
Предложенная схема состоит из трёх шагов. На первом этапе субфракционные образцы подверглись исследованию методом протонного ядерного магнитного резонанса (1H-NMR) и оценке активности. Применялся кластерный тепловой картографический метод группировки данных 1H-NMR и активности, позволяющий выявить группы активных соединений. На втором шаге фракции интересующих образцов были проанализированы методом углеродного поляризационного переноса без искажения интенсивности спектра (13C-DEPT NMR).
Фракции, содержащие потенциально новые активные соединения, очистили полуаналитической HPLC.
Изолированные соединения дополнительно оценили методами двумерного NMR и высокочувствительной электрораспылительной масс-спектрометрии (HRESIMS), подтвердив их функциональную значимость. Третий этап включал молекулярный сетевой анализ на основе LC-MS/MS для изучения следов других активных соединений.
Результаты
В ходе исследования экстракт дитерпенов обжаренного кофе методом колоночной хроматографии на силикагеле разделяли на 19 фракций. Спектры 1H-NMR каждой фракции изучались для вычисления интегральных значений характерных областей. Полученный матричный кластерный тепловизионный график состоял из 19 строк и 1167 столбцов.
По результатам кластерного анализа, основанного на данных 1H-NMR, фракции распределились на пять групп. Так как группа фракций Fr.1-Fr.3 не проявила никаких признаков активности в подавлении альфа-глюкозидазы, дальнейший анализ этих фракций был прекращён. Среди четырёх оставшихся групп наибольшую активность в подавлении альфа-глюкозидазы показала группа фракций Fr.9-Fr.13.
Объединённый анализ данных кластерного тепловизионного графика и спектров 1H-NMR подтвердил наличие в группе фракций Fr.9-Fr.13 соединений, обладающих способностью подавлять альфа-глюкозидазу. Затем образец фракции Fr.9, представляющий активную группу (Fr.9-Fr.13), исследовался с использованием метода 13C-DEPT NMR, который показал присутствие специфичного карбонильного сигнала альдегидных групп.
Анализ образца фракции Fr.9 методом HPLC позволил выявить три хроматографические пика. Полупрепаративная HPLC позволила очистить полученные соединения, получив соединения №1-№3.
Спектр 1H-NMR указал на наличие двух метильных групп, одной окислённой метиленовой группы, трех олефиновых протонов и одной альдегидной протонной группы. Данные 13C-DEPT NMR подтвердили наличие суммарно 36 атомов углерода. Метод 13C NMR показал, что соединение №1 представляет собой дитерпеновый эфир с шестнадцатью насыщенными жирнокислотными карбонами.
Анонсы статей смотрите в Telegram или ОК
Хотя спектральные данные 1H-NMR и 13C NMR соединений №2 и №3 аналогичны соединению №1, согласно данным 13C NMR и HRESIMS, соединение №2 обладает двумя дополнительными метиленовыми группами, а соединение №3 имеет четыре дополнительные метиленовые группы в длинной цепи жирной кислоты по сравнению с соединением №1. Важно отметить, что соединения №1-№3 фракции Fr.9 проявляли активность ингибиторов альфа-глюкозидазы.
Совместный анализ полученных данных с результатами HRESIMS выявил три новых следовых дитерпенэфирных компонента кофе: магариновая кислота, октадекановая кислота и нонадекановая кислота, которые также обладают потенциалом подавления альфа-глюкозидазы.
Заключение
Из сырьевых экстрактов Coffea arabica были выделены три новых дитерпенэфирных соединения — каффальдегиды A, B и C, характеризующиеся значениями IC50 сильнее препарата акарбозы.
Интересно: Два обычных продукта, смертельных даже для устойчивых к антибиотикам бактерий
Путём молекулярно-сетевого подхода на основе LC-MS/MS были определены три новых дитерпенэфирных соединения с аналогичной активностью.
Предложенный в работе метод может применяться для выделения целевых активных метаболитов других продуктов питания.
Автор: Dr. Priyom Bose
Перевод: Виктор Трибунский
Источник