Почему измерять температуру клетки сложно
Мы поняли, как важна температура для жизни и откуда она берется, и возникает вопрос: «А какая она прямо внутри клетки?» Казалось бы, температура — вещь «глобальная», в таком малом объеме она должна мгновенно выравниваться с окружением. Долгое время так и думали: внутри клетки везде одинаковые +37°C. Но ученых не оставляла идея: а вдруг там есть «горячие точки» — микрообласти, где идет интенсивная реакция, и температура на доли градуса выше? Ведь клетка неоднородна, и органоиды работают с разной интенсивностью в связи с разными функциями. Митохондрии синтезируют АТФ и часто работают сверхурочно, а липидные капли на мембране эндоплазматического ретикулума (ЭПР) отдыхают и ждут своего включения в синтетические пути. Проверить это долгое время не представлялось возможным — не было инструментов, и вот почему.
- Во-первых, размер. Термометр даже в виде микрозонда всё равно будет огромен по сравнению с клеткой и, касаясь ее, либо измерит свою собственную температуру, либо убьет клетку.
- Во-вторых, есть проблема масштаба времени. Температура — понятие равновесное. Чтобы говорить о температуре в точке, нужно, чтобы молекулы успели обменяться энергией между собой и достигнуть локального термодинамического равновесия. Клетка маленькая, но не бесконечно: при типичном размере ~10 мкм внутри нее температура выравнивается за микроскопические доли секунды (порядка 10−5 с). То есть локальное равновесие устанавливается очень быстро, и в принципе имеет смысл говорить о локальной температуре. Однако если одновременно происходят быстрые процессы (например, реакция бурно выделяет тепло), могут возникать микроградиенты на очень короткое время. Поймать их — технический вызов.
- Ну и в-третьих, амплитуда ожидаемо мала. Если митохондрия выделяет тепло, оно быстро уходит в виде кинетической энергии молекул в окружающую цитоплазму и затем — по всему объему клетки наружу. Расчеты показывают, что самостоятельно одна клетка не может сильно нагреть себя — слишком уж велика теплоемкость воды и быстро охлаждение. Критики идеи «горячих точек» утверждали, что прирост будет ничтожным (тысячные доли градуса). Однако прямых экспериментальных данных не было, шли споры теоретиков и экспериментаторов. Для науки это классическая ситуация. Новое направление рождает дискуссии, пока не появятся надежные методы измерения.
Алмазы с квантовыми центрами — это метод, заслуживающий особого внимания. Оказывается, даже алмаз можно заставить измерять температуру. Причем не где-нибудь, а прямо внутри живой клетки — с колебаниями всего в 0,05 Цельсия! Звучит как фантастика, но именно так работают так называемые алмазные наночастицы с квантовыми дефектами. Кстати, перспективу развития этого метода мы уже обозревали в нашей статье от 2015 года, в которой разбирается механизм работы таких приборов.
Такие сенсоры не только стабильны, инертны и нетоксичны, но еще и умеют светиться особым образом, позволяя определить температуру по сдвигу их флуоресценции. Впервые их применили в клетках в 2013 году, и с тех пор именно этот подход считается одним из самых перспективных в наноразмерной термометрии. Ни красители, ни белки не дают такой точности и долговечности. Поэтому наноалмазы — это уже не просто экзотика, а вполне рабочий инструмент, заслуживающий особого внимания.
Такие кристаллы состоят из алмаза — упорядоченной кристаллической решетки атомов углерода. Однако решетка не идеальна: в ней присутствуют точечные дефекты с атомом-примесью (обычно азота или кремния) — так называемые цветные центры. Называются они так потому, что флуоресцируют при возбуждении светом. Кроме этого, у такого центра есть неспаренный электрон, квантовое состояние которого зависит от окружения. Измерение в этом случае основано на тепловом расширении решетки алмаза вокруг этого электрона и детектируемом через интенсивность флуоресценции центра изменении его квантовых свойств. Огромный плюс алмазных сенсоров — это их инертность и стабильность. Алмаз нетоксичен, не блекнет, не вступает в реакции. Его флуоресценция не выгорает со временем — в отличие от органических красителей. Поэтому нанокристалл алмаза можно внедрить в клетку и наблюдать за ним сколь угодно долго.
Как мы теперь понимаем, измерения алмазного нанодатчика всегда зависят от степени расширения кристаллической решетки, зависящей от температуры самого кристалла. При хорошем тепловом контакте эта температура равна температуре окружающей среды (клетки). В первых экспериментах требовались калибровка и выдерживание равновесия, чтобы гарантировать, что показания алмаза соответствуют локальной температуре клетки. Иными словами, ограничение ранних нанотермометров состояло в необходимости увериться, что «собственная» температура алмаза отражает температуру клетки. И главное — ранние нанодатчики только измеряли, но не могли локально греть клетку. Современная же наука шагнула гораздо дальше и превратила обычные термометры в полноценные термоконтроллеры.
Наноконтроллеры для мегазадач
Совсем недавно компания «Вандер Технолоджис» разработала новый способ точечного нагрева отдельных живых клеток и их внутренних областей. Для этого они использовали одиночную алмазную частицу, в структуре которой, кроме описанных выше цветных центров, есть участки с аморфным углеродом. Эти аморфные зоны хорошо поглощают лазерное излучение и локально нагреваются, а встроенные цветные центры — позволяют одновременно отслеживать изменение температуры по сдвигу флуоресценции. То есть одна и та же частица одновременно играет роль и нагревателя, и термометра.
В 2023 году в журнале Nature вышла статья от наших соотечественников, описывающая первые результаты использования алмазного термоконтроллера. Что же показало применение нового прибора? Эксперименты были проделаны на одиночных клетках HeLa и на нейронах мыши в культуре. Алмазную частицу помещали впритык к клетке и нагревали лазером примерно на 11–12°C выше температуры окружающей среды. Поскольку эксперименты шли при комнатной температуре (~22°C), локально клетку грели до ~34°C, то есть имитировали повышение температуры, близкое к лихорадочному, но не убийственному.
Что произошло? Оказалось, что клетка очень интересно реагирует на такое воздействие: в ней изменяется концентрация свободного кальция в цитоплазме. В HeLa-клетках спустя десятки секунд локального нагрева удалось наблюдать трехкратное увеличение кальциевого сигнала. То есть тепло запустило высвобождение Ca2+ из внутренних депо, например, через уже упомянутые термочувствительные IP3-рецепторы на ЭПР. В нейронах тоже произошел кальциевый всплеск, хотя меньшей амплитуды и очень краткий (~0,4 с) — возможно, за счет других каналов. Фактически ученые вызвали у клетки тепловой мини-шок и зафиксировали биологический ответ — повышение концентрации сигнальной молекулы Ca2+.
Новизна этого метода заключается в контроле такого параметра системы, о котором раньше не думали. Метод измерения и изменения градиентов температур внутри клетки дает огромное поле для будущих исследований, диагностики и терапии. Именно поэтому новый прибор может найти свое место во многих лабораториях. Такое инновационное оборудование для своих исследований можно заказать у российской компании «Вандер Технолоджис», в частности, написав на мейл.
Больше о важности температуры в жизнедеятельности клетки читайте на нашем сайте!