Микроклональным размножением называется процесс выращивания in vitro на специальных питательных средах новых полноценных дочерних растений из частей растения-донора, которые в дальнейшем адаптируют к нативным климатическим условиям. Это становится возможным благодаря способности растений размножаться бесполым путем. При вегетативном размножении дочерняя особь полностью идентична материнскому организму (является ее клоном), полностью сохраняет генетическую информацию от материнского растения, так как образуется из ее соматической клетки. Но одно из существенных затруднений вегетативного размножения — сложность получения большого количества сортового растения или сложность приживаемости некоторых растений (например, древесных или взрослых растений), а также накопление во взрослом растении патогенов (вирусов, грибов и т.п.), которые переносятся в дочерний организм во время деления.
Поэтому биотехнологами был разработан быстрый и удобный метод — микроклональное размножение растений, который из чисто научного подхода уже превратился в коммерческий метод получения большого количества сортовых и трудноприживаемых растений.
В микроразмножении растений используется как каллусная* ткань с последующим органогенезом, так и меристематическая** ткань.
- *каллус — в биотехнологии называют массу недифференцированных клеток, они являются тотипотентными и поэтому из каждой такой клетки способен развиться целый организм;
- *меристема — общее название быстро делящихся и физиологически активных клеток, которые отвечают за наращивание массы и способны дать развитие специализированным тканям растений.
Преимущества микроразмножения по сравнению с традиционными путями получения генетически идентичных особей:
- получение генетически однородного материала;
- снижение титр-вируса в культуре;
- высокий выход получения клонов (увеличение числа клонов и в будущем выросших растений;
- размножение растений, сложноразмножаемых растений (хвойные);
- проведение опытов в продолжении 365 дней;
- поддержание гетерозисных гибридов для избежания расщепления во время скрещивания растений;
- для сохранения редких и исчезающих видов растений (например, женьшеня на Дальнем востоке);
- в селекции поддержание некоторых отдельных генотипов.
Микроклональное размножение в большинстве случаев идет в 3 последовательные стадии:
- получение растительной культуры;
- увеличение количества пропагул***;
- подготовка микроклонов к условиям ex vitro.
*** пропагулы — в общем смысле слова это органы растения, способные дать в будущем целую популяцию.
Получение растительной культуры помимо подготовки маточных растений с целью снижения содержания патогенных микроорганизмов включает в себя стерилизацию растительного материала и перенос на питательные среды. Задача этой стадии — получение жизнеспособных эксплантов, у которых снижена вирусная нагрузка.
Питательные среды для микроклонирования растений
Ученые предпочитают использовать среду Мурасиге-Скуга (MS) в различных модификациях. Она показывает хороший результат при каллусообразовании у многих растений, позволяет оптимально поддерживать неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у двудольных. Для культивирования бобовых, злаков можно использовать среду Гамборга В5, для укоренения побегов — среду Уайта, среда Нича — для морфогенеза злаков.
Любая среда имеет гетерогенный состав, содержит микро- и макроэлементы, является источником углерода (из сахарозы и глюкозы), которые во время стерилизации среды распадаются до легкоусвояемых моносахаридов, в среду добавляют витамины (пиридоксин, аскорбиновую и пантотеновую кислоты, тиамин, рибофлавин, биотин), иногда добавляют антиоксиданты (глутатион, ДТТ) и регуляторы роста.
Гелеобразующие вещества — используются как уплотняющий компонент твердых питательных сред. Агар для микроклонирования проходит строгий контроль, обладает высокой прочностью геля, что позволяет использовать низкие концентрации (0,4-0,6 %), имеет низкую мутность для визуализации процесса роста корней в среде, плавится при температуре 85 ± 5 С и затвердевает при температуре 35 ± 5 С. Твердые питательные среды дают большую опору для развивающегося растения, но иногда питательные вещества в такой среде распределены неравномерно, иногда исследователи используют комбинированные среды, например нижний слой твердый, а верхний жидкий.
Регуляторы роста — фитогормоны (phytos — растения + гормоны) выполняют в жизненном цикле растений координирующие и регулирующие функции. Регулирование морфогенеза при помощи фитогормонов лежит в основе микроразмножения растений.
Цитокинины убирают апикальное доминирование и индуцируют развитие пазушных почек, нарушают покой и стимулируют рост покоящихся органов. Регулируют рост соматических зародышей и формирование растений. Они нужны для дифференциации стеблевых почек в культуре каллусных тканей и при регенерации побегов из клеток экспланта. Кроме того, цитокинины участвуют в замедлении старения органов и повышении их устойчивости к неблагоприятным условиям внешней среды. В микроразмножении в основном используют гибберллин А3 (гибберелловая кислота, ГК3). Экзогенные гиббереллины усиливают рост и вытягивание стебля, листьев, индуцируют прорастание семян, снимают состояние покоя. Под влиянием гиббереллинов удлиняются цветоножки, увеличиваются размеры и количество цветков. ГК3 вносят в питательную среду чаще всего для ускорения роста сформировавшихся почек и получения растения с сильно развитой надземной частью. Самые популярные цитокинины: кинетин, бензиламинопурин, зеатин. Самые популярные ауксины — индолилуксусная кислота и нафтилуксусная кислота в концентрации до 0,5 мг/л.
Антибиотики/антимикотики добавляются в среду для стерилизации от возможной внутриорганной инфекции растения.
Тест-наборы для детекции вирусов — используются для контроля за разными типами вирусных болезней растений.
Ауксины оказывают такое влияние на клетки, как растяжение, деление и дифференцировка. Самым выраженным органогенным эффектом ауксинов является стимуляция образования корней.
Следующая стадия — это увеличение количества растений, реализуется чаще всего микрочеренкованием. Полученные микроклоны пересаживаются на новые питательные среды, и этот процесс облегчается использованием пластика для культур растительной ткани. Данная посуда позволяет масштабировать эксперимент, при этом не занимая много места, за счет штабелирования или компактной посадки. Помимо этого некоторые модели стерильны или возможно их автоклавирование, что снижает риск загрязнения (контаминации).
Завершающая стадия — адаптация микроклонов к условиям ex vitro. Во время этого этапа происходит открывание культивационных сосудов и прекращение использования стерильных условий. Растения обрабатываются корнеобразователями (ауксины), высаживаются на твердый субстрат и помещаются в условия повышенной влажности. В этот период рекомендуется обрабатывать растения адаптогенами, антиоксидантами и т.п. Для проверки качества почв можно использовать удобные портативные солеизмерители, а так же измерители значения рН почвы и минерального состава.
Микроклонирование в лабораторных условиях — это многоэтапный процесс и каждый этап крайне важен. Для успешного культивирования первостепенное значение имеет чистота! Она обеспечивается как ламинарными шкафами, автоклавами, дистилляторами для получения чистой воды, так и стерильными расходными материалами.
Дополнительным оборудованием для успешного культивирования клонов являются климатические камеры, стеллажи и комнаты роста растений, горелки, мешалки, скальпели.
