Вертикальный электрофорез представляет собой метод разделения заряженных макромолекул в полиакриламидном геле (ПААГ) под действием электрического поля. По сей день метод остается одним из популярных в молекулярной биологии и широко применяется лабораториями различного профиля для определения и анализа (нуклеиновых кислот) НК и белков, а также их фрагментов.
Принцип работы вертикального электрофореза
Электрофорез в ПААГ базируется на разделении молекул в электрическом поле в условиях ограниченной диффузии. Для этого гель устанавливается вертикально между анодным и катодным буферными резервуарами. ПААГ является матрицей, которая позволяет разделить белки и НК по их размеру и заряду. С помощью гребенки создаются лунки, в которые наносятся образцы. Для визуализации движения фрагментов в образцы добавляют краситель для отслеживания с более высокой электрофоретической подвижностью.
Электрическое поле, создаваемое двумя электродами – анодом и катодом, проходя через гель, задает движение молекул белков и нуклеиновых кислот к аноду.
На подвижность макромолекул в геле влияют разные факторы, которые стоит учитывать при проведении анализа. Основными из них являются:
- Заряд. При увеличении суммарного заряда возрастает подвижность молекул.
- Размеры. Проходя через гель более крупные молекулы задерживаются в порах геля, меньшие – более подвижные, проходят дальше, поэтому в результате электрофореза меньшие молекулы буду располагаться дальше от места нанесения, чем большие.
- Форма. На подвижность также влияет форма молекулы. При наличии одного и того же размера, но разной формы, молекулы будут иметь разную подвижность. Например, глобулярные и фибириллярные белки.
- Размер пор ПААГ. Молекулярное сито полиакриламидного геля задает скорость движения молекул в зависимости от размера пор. Чем меньше поры, тем медленнее движутся в нем крупные молекулы в отличие от мелких. Нужная пористось геля задается его концентрацией, которая может варьировать от 2 до 50%.
По окончании проведения электрофореза для визуализации разделенных фрагментов гель извлекают из камеры и проводят окраску специальными красителями, основанными на флюорохромах или белковых красителях.
Для определения размеров фрагментов образцы сравнивают с маркером молекулярного веса, содержащим фрагменты известного размера. Результаты могут быть визуализированы с помощью гельдокументирующей системы, что обеспечивает быструю и точную визуализацию и оценку размера фрагментов.
Особенности белкового электрофореза
Нативный электрофорез нужен для разделения цельных белков, нативных, не денатурированных, например, когда требуется сохранить ферментативную или другую функциональную активность белков.
Если требуется разделить белки строго по молекулярной массе, используется ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях, достигаемых обработкой пробы додецилсульфата натрия (SDS), что лишает белки вторичной, третичной или четвертичной структуры. Белки, благодаря SDS, обладают значительным суммарным отрицательным зарядом, поэтому дальнейшее разделение в ПААГ идет исключительно по молекулярной массе. В качестве денатуранта можно также использовать мочевину.
Достоинства и применение
Электрофорез в полиакриламидном геле обладает следующими достоинствами:
- Высокая разрешающая способность – позволяет разделить молекулы по их размеру и заряду, что позволяет определить даже незначительные различия между образцами.
- Высокая чувствительность – позволяет обнаруживать белки и НК очень малых концентраций.
- Широкое применение. Электрофорез в ПААГ применяется в многочисленных областях биологии и медицины, включая иммунологию, молекулярную биологию, биохимию и генетику, а также другие научные области.
- Возможность модификации. Поры ПААГ регулируются простым и управляемым способом путем изменения концентрации акриламида, что актуально для разделения частиц с меньшей молекулярной массой.
Электрофорез в ПААГ является одним из основных методов анализа белков и нуклеиновых кислот.
Применение электрофореза в полиакриламидном геле
- Определение количества и качества белков и нуклеиновых кислот;
- идентификация белков и нуклеиновых кислот (например, определение фальсификации белкового состава);
- очистка и оценка чистоты белков (например, на различных стадиях хроматографического разделения);
- сбор данных о регуляции экспрессии белков, определение размера, изоэлектрической точки и ферментативной активности;
- анализ ДНК, включая секвенирование и определение мутаций;
- изучение реакций поперечной сшивки ДНК.
Оборудование и принадлежности для вертикального электрофореза
Для проведения вертикального электрофореза нуклеиновых кислот и белков необходимо использовать реактивы и оборудование, которые удовлетворят потребности и требования лабораторных исследований. Мы предлагает широкий выбор проверенных реактивов и оборудования для проведения вертикального электрофореза таких производителей, как: diaGene (Диаэм, Россия), WSHT (Китай), Servicebio (Китай), neoFroxx (Германия), CDH (Индия), Vazyme (Китай). На ваш выбор представлены как готовые наборы, так и отдельные реактивы для вертикального электрофореза.
Оборудование для электрофореза включает источник питания и электрофорезную вертикальную камеру. Источник питания нужен для генерации стабилизированного постоянного тока и контроля силы тока и напряжения на выходе.
Электрофорезную вертикальную камеру следует выбирать, исходя из следующих характеристик: количество гелей (от 1 до 12), размер геля (от 7 до 20 см), толщина геля (0,75;1,0; 1,5 мм), количество образцов на гель (от 1 до 120), объем буфера (от 200 до 6000 мл). Также следует учесть возможность проведения блоттинга в этой же камере.
Для формирования геля при заливке используются: стекла (одинаковые по ширине, но разные по длине), спейсеры (определяют толщину геля), гребенки с многообразием размеров зубцов для формирования лунок, зажимы.
Визуализировать результаты разделения макромолекул можно с помощью трансиллюминаторов и гель- и хемидокументирующех систем. В процессе работы следует использовать специальные очки и защитные маски для защиты глаз.
ПААГ представляет собой продукт сополимеризации акриламида, создающего линейную основу, и N,N′-метилен-бис-акриламида (бисакриламид), который служит для поперечного сшивания линейных цепей. В качестве инициатора реакции сополимеризации выступает персульфат аммония (ПСА), а N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамином (TEMED) используется в качестве катализатора.
Для самостоятельной заливки гелей концентрации 6, 8, 10, 12% компания Servicebio (Китай) предлагает готовые наборы, имеющие ряд преимуществ:
- Легкое и быстрое приготовление гелей по готовым протоколам.
- Краситель, входящий в состав набора, позволяет подкрашивать верхний (концентрирующий) гель, что делает лунки заметными, а нанесение образца удобным.
- Краситель не диффундирует в разделяющий гель и не влияет на качество разделения смеси белков.
Для вертикального электрофореза белков компания WSHT (Китай) представляет широкий выбор готовых гелей для разных задач эксперимента.
Для вертикального электрофореза используют различные буферные системы в зависимости от характеристик образца и цели исследования. При этом катодный и анодный буфер может быть одинаковыми или разными. Буфер можно приготовить самостоятельно, используя необходимые компоненты: трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), натрия додецилсульфат (SDS). Также есть готовые буферы для экономии времени: трис-HCl (TBS), трис-ЭДТА (ТЕ), трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ), трис-борат-ЭДТА (TBE), трис-глициновый буфер как с SDS, так и без него.
TAE и TBE являются наиболее распространенными буферами, используемыми при полиакриламидном гель-электрофорезе НК. TBE-буфер рекомендуется применять для разделения малых фрагментов НК с высоким разрешением, TAE-буфер – если планируется очистка ДНК из геля с последующим клонированием или проведением других ферментативных реакций.
Отслеживающий краситель может быть представлен как отдельными компонентами, так и в виде готового буфера для загрузки образцов.
После проведения электрофореза для визуализации разделенных фрагментов гель извлекают из камеры и проводят окраску. Для белков, как правило, используется Кумасси 250 и Понсо S, для ДНК и РНК – бромистый этидий.
Выбор маркера молекулярного веса белков или нуклеиновых кислот зависит от поставленной задачи эксперимента. Неокрашенные стандарты подойдут, если нужно определить вес искомого белка и/или количество фракций в образце с дальнейшим окрашиванием геля. Если же планируется проводить после ПААГ вестерн-блоттинг, то подойдет любой окрашенный маркер с подходящим диапазоном масс, взаимодействующий со вторичными антителами, используемыми в эксперименте.
