На протяжении истории жизни на Земле генетическая информация хранилась в коде, состоящем всего из 20 аминокислот. Аминокислоты являются строительными блоками белков, которые выполняют большую часть тяжелой работы в клетке; их боковые цепи управляют укладкой белков, взаимодействиями и химической активностью. Ограничивая доступные боковые цепи, природа эффективно ограничивает типы реакций, которые могут выполнять белки.
В 1980-х годах Питер Шульц задался вопросом, почему природа ограничила себя таким образом, и попытался обойти это ограничение. Несколько лет спустя, будучи профессором Калифорнийского университета в Беркли, Шульцу и его команде удалось сделать это, поработав с механизмом синтеза белка. Хотя эта работа была ограничена пробиркой, она ознаменовала собой ключевой ранний успех в усилиях по взлому генетического кода.
С тех пор многие исследователи пошли по стопам Шульца, настроив клеточный аппарат для построения белков как для изменения существующих макромолекул, так и для создания полимеров из совершенно новых строительных блоков. Полученные молекулы могут быть использованы в исследованиях и для разработки терапевтических средств и материалов. Но это был тяжелый труд, потому что синтез белка — важнейшая клеточная функция, которую нелегко изменить.
Из пробирки в живые клетки
Во время транскрипции инструкции ДНК копируются в РНК, которая затем транслируется в белки в молекулярной машине, называемой рибосомой. Каждый триплет оснований в сообщении РНК (аденин, цитозин, гуанин и урацил) представляет собой слово или кодон генетического кода. Всего 64 слова — 61, которые кодируют аминокислоты, и 3, которые сигнализируют об остановке рибосомы.
Аминокислоты доставляются к рибосоме транспортными РНК (тРНК), каждая из которых соответствует комплементарному кодону. Ферменты, известные как аминоацил-тРНК-синтетазы, связывают тРНК с родственной ей аминокислотой.
Чтобы заставить эту систему принимать неестественные или «неканонические» аминокислоты в пробирке, потребовалось несколько ключевых настроек. Во-первых, команда Шульца разработала способ химического присоединения неприродных аминокислот к тРНК, которая могла распознавать один из трех стоп-кодонов. Затем они ввели стоп-кодон в ген белка устойчивости к пенициллину, бета-лактамазы. Используя эти модификации, исследователи изучили, как различные неканонические варианты белка влияют на активность фермента.
Но это было в пробирке. Чтобы включить неканонические аминокислоты в живые клетки, команде пришлось дополнить аппарат трансляции, не изменяя его. Они сделали это, идентифицировав и модифицировав тРНК и аминоацил-тРНК синтетазы, которые были биоортогональны клетке-хозяину, то есть неспособны распознавать (и распознаваться) другими частями клеточного механизма трансляции.
Как взломать геном
Команда Шульца остановилась на паре тРНК-синтетаз археи, Methanococcus jannaschii, которая с трудом распознавала тРНК или синтетазы бактерий Escherichia coli. Команда оптимизировала молекулы, чтобы они были селективными к новой аминокислоте. В 2001 году исследователи внедрили эту систему в E. coli , позволив клеткам включать нестандартные аминокислоты в белки, используя свой собственный механизм трансляции.
Растущий набор инструментов
Команда Шульца и другие исследователи использовали этот подход для генетического кодирования более 200 нестандартных аминокислот в белки, что стало мощным инструментом для изучения структуры и функций белков. Ученые могли бы, например, ввести флуоресцентные маркеры или другие метки в белки или провести эксперименты по фотоклейке, в которых белки становятся неактивными («запираются») химическими группами, которые могут быть удалены светом.
Ученые также вышли за пределы E. coli для взлома генетических кодов червей-нематод, дрозофил, растений и даже мышей. Чин вместе с Майклом Хастингсом, нейробиологом из Кембриджского университета, и их коллегами, например, взломали тРНК и тРНК-синтетазу для аминокислоты пирролизина, чтобы включить аминокислоту, называемую алкин-лизин N 6 -[(2 - пропинилокси ) карбонил]- 1-лизин (AlkK) в белки. Они использовали его как переключатель для включения и выключения генов в клетках мозга мыши. Исследователи удалили ключевой белок, участвующий в регуляции циркадных ритмов — суточных циклов, контролируемых внутренними часами организма, — и ввели в клетки новую версию гена, которая могла транслироваться только в присутствии AlkK. Поскольку мыши не могли производить эту аминокислоту самостоятельно, исследователи могли контролировать их циркадные ритмы, добавляя или удаляя аминокислоты из питьевой воды грызунов.
Шульц использовал расширенный генетический код, чтобы выяснить, как бы выглядели организмы, если бы у них было более 20 аминокислот для игры. В одном исследовании его команда создала библиотеку вариантов гомосерин-О-сукцинилтрансферазы E. coli , фермента, участвующего в биосинтезе аминокислоты метионина, которая особенно чувствительна к температуре, в которой каждый кодон вне каталитического центра фермента был заменен на кодон. неканоническая аминокислота, ( п -бензоилфенил)аланин (pBzF). Команда обнаружила вариант, который был стабилен при температуре до 21 °C выше типичного диапазона — подвиг, который они приписали образованию химической связи между pBzF и другой аминокислотой.
Исследователи также начали применять эту технологию для разработки терапии. Лей Ван, биолог-химик из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, например, разрабатывает лекарства на основе белков, которые могут образовывать ковалентные связи с другими биомолекулами.
Белки обычно взаимодействуют с другими молекулами посредством относительно слабых нековалентных взаимодействий, но ковалентная связь может повысить их эффективность, говорит Ван. В 2020 году его команда включила неканоническую аминокислоту фторсульфат- L -тирозин (FSY) в PD-1, белок контрольной точки иммунитета, который помогает обуздать иммунный ответ организма, для создания противоопухолевого препарата. Как правило, взаимодействие между PD-1 на Т-клетках и PD-L1 на опухолевых клетках ослабляет иммунный ответ, позволяя опухоли избежать иммунного надзора. Когда FSY-содержащий PD-1 ввели мышам, пересаженным раковыми клетками человека, белок образовал необратимую ковалентную связь с PD-L1, заставив опухоли уменьшиться.
Химик и синтетический биолог из Пекинского университета, и его команда примерно в то же время применяют генетическую экспансию в клеточной и генной терапии. В исследовании 2021 года Лю и его команда сообщили о создании клеток, которые в присутствии синтетической аминокислоты O -метилтирозина экспрессируют инсулин. При имплантации мышам с диабетом исследователи могли контролировать уровень глюкозы в крови животных, контролируя, сколько О -метилтирозина они выдавали в пищу животных.
Расширение приложений
Помимо кодирования новых аминокислот, одним из применений расширенного генетического кода является генетическая изоляция. С 61 кодоном для 20 аминокислот генетический код является избыточным, а это означает, что несколько кодонов кодируют одну и ту же аминокислоту. Он также почти универсален. Заменяя все экземпляры данного кодона на синонимичный и удаляя механизм, использующий исходный кодон, исследователи могут сделать клетку эффективной невосприимчивой к чужеродной ДНК, включая патогены.
В исследовании 2022 продемонстрировали эту концепцию; создали мутант E. coli , в котором два из шести его кодонов серина были переназначены для кодирования других аминокислот, а затем они удалили тРНК, которые распознавали исходные кодоны серина. Они дополнительно настроили систему, чтобы гарантировать, что вирусы не смогут использовать свои собственные тРНК, если они у них есть.
Полученные клетки были устойчивы к горизонтальному переносу генов от других бактерий, а также к вирусной инфекции. Другая группа, возглавляемая биологом-синтетиком Джорджем Черчем из Гарвардского университета в Кембридже, применила аналогичный подход «генетического брандмауэра» для создания устойчивых к фагам бактерий.
Исследователи также могут использовать модифицированный генетический код для создания полимеров. В 2021 году команда Чина взломала генетический код, чтобы синтезировать короткие полимеры и даже искусственную кольцевую структуру, называемую макроциклом, в E. coli. Теперь Чин надеется продвинуть эту технологию дальше, чтобы создать клеточные фабрики, которые смогут производить совершенно новые полимеры, такие как пластмассы. Как и белки, пластмассы состоят из длинных цепочек мономеров. Но хотя генетический код диктует последовательность аминокислот в белках, для искусственных полимеров не существует эквивалентной системы.
Раздвигая границы
Помимо переназначения кодонов, исследователи также могут увеличить количество доступных строительных блоков белка, расширив алфавит нуклеиновых кислот с четырех оснований до шести, тем самым увеличив количество возможных триплетных кодонов до 216. В 2014 году группа под руководством биохимика Флойда Ромесберга, который был тогда в Scripps Research, сообщил о создании бактериального штамма с генетическим алфавитом из шести оснований, который мог бы успешно воспроизводить. Впоследствии группа продемонстрировала, что эти клетки могут использовать свою расширенную ДНК для производства белков, содержащих неканонические аминокислоты.
Другой подход состоит в том, чтобы увеличить длину кодона с трех оснований до четырех, тем самым увеличив количество возможных кодонов до 256. Это требует модификации нескольких частей механизма трансляции, включая рибосому. Chin и его команда использовали эту стратегию для включения четырех неканонических аминокислот в E. coli в транскрипт, который также содержит обычные кодоны из трех оснований. Другие исследователи изучают возможность создания генетического кода, полностью состоящего из квадруплетов.
Некоторые исследователи пытаются внести более экстремальные изменения. К ним относятся модификации остова — создание так называемых β- или γ-аминокислот (в отличие от α-аминокислот, встречающихся в природе) или аминокислот, являющихся обратными зеркальными отражениями стандартных аминокислот. Полимеры, построенные из строительных блоков любого типа, вероятно, будут очень стабильными, потому что типичный механизм расщепления белка не сможет их распознать.
Но существующий механизм трансляции не приспособлен для приема этих экзотических аминокислот, включая аминоацил-тРНК-синтетазы, которые присоединяют аминокислоты к тРНК. Хироаки Суга, химик-биолог из Токийского университета, в 2006 году разработал обходной путь с помощью «флексизима», катализатора на основе РНК, который может выполнять работу протеинсинтетаз: связывать аминокислоты с тРНК.
Суга фокусируется на синтезе полимеров in vitro , потому что это обеспечивает наибольшую гибкость с точки зрения модификаций, которые он может производить. Используя флексизим, его команда объединила до 11 неканонических аминокислот с 12 стандартными аминокислотами в одном макроцикле. Суга стал соучредителем биотехнологической компании PeptiDream, базирующейся в Кавасаки, Япония, для разработки лекарств с использованием той же технологии.
Однако опять же, эта работа проводится in vitro ; применение модифицированных скелетом или конфигурацией аминокислот к белкам в клетках остается сложной задачей. Хотя есть несколько случаев, когда ученые смогли включить эти более экзотические аминокислоты, необходимы дальнейшие шаги, чтобы сделать процесс более эффективным. Помимо поиска синтетаз, которые могли бы работать с этими аминокислотами in vivo , во многих случаях ученым нужно было разработать рибосому, которая могла бы обрабатывать эти новые аминокислоты, продолжая при этом выполнять свои обычные функции.
В двух недавних исследованиях Аланна Шепарц, химик и синтетический биолог из Калифорнийского университета, и ее команда сообщают о шагах, направленных на решение этих проблем. В одной из статей описывается синтетаза из археи Methanomethylophilus alvus , которая может принимать не-α-аминокислоты и биоортогональна E. coli. В другом исследовании команда сообщает о вычислительной технике для скрининга уникальных мономеров остова, которые рибосома E. coli может эффективно обрабатывать. Исследователи говорят, что это поможет идентифицировать не-α-аминокислоты, которые, скорее всего, будут совместимы с существующей рибосомой.
Другие группы работают над созданием рибосомы, которая может с нуля производить белки с экзотическими аминокислотами. В октябре прошлого года исследователи из Университета Вестлейк в Ханчжоу сообщили о зеркальной РНК-полимеразе, которая может синтезировать все молекулы РНК, необходимые для производства зеркальной рибосомы. Хотя требуется еще много шагов, чтобы сделать рибосому зеркального отображения реальностью, создание такой молекулы было бы важным шагом на пути к использованию механизма трансляции для создания белков зеркального отображения.
Другие исследователи работают над перепрограммированием рибосом для создания полимеров с углерод-углеродными связями, в отличие от азот-углеродных амидных связей, которые они обычно создают, чтобы связать аминокислоты.
Если эти стратегии осуществятся, они наделят ученых огромной синтетической властью над новыми полимерами. Никто не знает, какие свойства могут появиться у синтетического полимера, созданного с той же длиной и уровнем определения последовательности, что и белок, потому что такие молекулы никогда не создавались.
