Винокурам на заметку!
СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ
Гликолиз является первым этапом спиртового брожения. Образовавшаяся пировиноградная кислота декарбоксилируется при участии декарбоксилазы в ацетальдегид, который затем восстанавливается до этанола. Эта реакция осуществляется алкогольдегидрогеназой с участием НАДН2 (табл. 5.2). В ходе этой реакции НАДН2 окисляется до НАД+ (см. рис. 5.1), который далее вновь участвует в гликолизе. Именно за счет использования ацетальдегида в качестве конечного акцептора электронов клетка обеспечивает дальнейшее функционирование гликолитического пути и вследствие этого дальнейшее образование АТФ для использования в биосинтетических реакциях.
Энергетический и химический баланс брожения:
С6 Н12 О6 + 2 АДФ + 2Фн 2СО2 + 2 СН3СН2 ОН + 2АТФ +2 Н2О + 61 кДж
Таким образом, выход АТФ в пути ЭМП составляет 2 молекулы на молекулу глюкозы. Эффективность брожения составляет 26 %; 74 % энергии не удерживается клеткой и в основном рассеивается в виде тепла, поэтому следует применять охлаждение аппаратов. Скорость брожения непостоянна, и наибольшая активность наблюдается первые 24–36 ч. Затем ввиду ингибирования клеток этанолом этот процесс замедляется.
Для протекания спиртового брожения в питательной среде должны присутствовать тиамин (витамин В1), а также ионы Zn+2, Co+2, Mg+2 и Mn+2 (см. табл. 5.2). Например, увеличение концентрации ацетальдегида вследствие замедления его восстановления в этанол происходит из-за недостатка ионов Zn+2 в среде, в результате Ф-1,6-Ф идет на биосинтез глицерина (см. рис. 5.1). Кислород является ингибитором брожения (эффект Пастера), механизм этого процес-са будет рассмотрен ниже.
Гликолитическая последовательность реакций является примером амфиболического пути, в ходе которого в биосинтетических реакциях клеткой используются различные промежуточные продукты:
– фосфорилированная глюкоза (Гл-1-Ф) является предшественником в синтезе полимеров клеточной стенки и резервных углеводов;
– триозофосфаты используются в синтезе жиров;
– фосфоенолпируват и пируват являются предшественниками некоторых аминокислот (рис. 5.2).
Однако размножающиеся клетки требуют значительно больше промежуточных продуктов для биосинтетических реакций, чем может предоставить путь ЭМП. Это такие вещества, как сукцинат, 2-оксоглутарат, оксалоацетат, которые являются предшественниками в синтезе восьми аминокислот. У дышащих дрожжевых клеток, т. е. таких, которые используют молекулярный кислород в качестве акцептора водорода и полностью окисляют глюкозу, синтез предшественников аминокислот протекает в цикле Кребса (ЦТК).
В анаэробных условиях активность ферментов цикла Кребса низкая. В результате из-за недостатка ключевого фермента 2-оксоглутаратдегидрогеназы, активность которого определяется концентрацией растворенного в среде кислорода, на участке сукцинат – 2-оксоглутарат ЦТК разомкнут (см. рис. 5.1).
При недостатке в среде растворенного кислорода у дрожжей функционируют два механизма, которые обеспечивают клетку необходимыми метаболитами: первый предусматривает образование сукцината, фумарата, малата и оксалацетата в окислительном процессе, в то время как второй включает синтез дополнительных ферментов для образования 2-оксоглутарата по восстановительному пути (см. рис. 5.1). Согласно обоим механизмам, пируват превращается в ацетил-КоА в реакции, включающей пируватдегидрогеназный комплекс, в состав которого входит пируватдегидрогеназа, дигидроамид-ацетилтрансфераза, дигидроамидредуктаза. В качестве коферментов комплекс содержит Mg+2, тиаминпирофосфат, флавинадениндинук-леотид (ФАД) и никотинамиддинуклеотид (НАД).
Суммарнаяя реакция имеет следующий вид:
Пируват + КоА-SН + НАД+ СО2 + Ацетил-SКоА + НАДН2
Таким образом, обмен глюкозы при недостатке кислорода в среде соответствует ЦТК в аэробном метаболизме: окислительный путь ведет от оксалоацетата к 2-оксоглутарату, восстановительный – к сукцинату.
Вовлечение оксалоацетата в разорванный ЦТК предполагает дополнительный синтез оксалоацетата за счет протекания анаплеро-тической (восполняющей) реакции:
Пируват + СО2 + АТФ оксалоацетат + АДФ
Катализирует эту реакцию АТФ и пируваткарбоксилаза – фермент, в котором биотин является простетической группой, а цинк – коферментом. Это единственная реакция, которую можно рассматри-вать как анаплеротическую в ходе ЦТК, которая восполняет недостаток оксалоацетата, расходуемого для биосинтетических реакций.
ПИТАНИЕ ДРОЖЖЕЙ
Жизнедеятельность дрожжей заключается в процессах питания, дыхания, роста и размножения. Одновременно с этими процессами идет синтез вторичных метаболитов, которые представляют большой интерес для пивоварения и виноделия, так как они обусловливают вкус и аромат напитков.
Источники питания, необходимые любому организму, в том числе и дрожжам, можно разделить на следующие группы:
– основные элементы: С, Н, О и N;
– элементы, требующиеся в небольших количествах (макроэле-менты): Р, К, S, Mg;
– микроэлементы (Zn, Mn, Co, Ca, Fe, Cu и др.);
– витамины.
Потребность дрожжей в питательных компонентах может различаться качественно и количественно в зависимости от условий культивирования, в частности может изменяться потребность в факторах роста при изменении температуры, рН и осмоляльности среды. Известно, что при небольшом количестве посевного материала требуется более богатая среда, чем для начала роста популяции с высокой плотностью. Это связано с тем, что многие элементы и ви-тамины могут накапливаться в клетках при их культивировании в средах с высоким содержанием элементов и затем использоваться в биосинтезе. Использование такого посевного материала приводит к снижению требований к питательной среде, в которую он вносится. Например, биосорбция ионов цинка в среде, содержащей 800 мг
Zn+2/л, может составлять 52,5 мг/г абсолютно сухой биомассы (АСБ), в то время как обычно дрожжи содержат всего 0,039 мг/г АСБ. В дрожжах также могут накапливаться витамины. Например, содержание биотина в клетках может достигать 0,6 мкг/г АСБ.
Дрожжи потребляют только растворенные в воде компоненты. Поступление веществ в клетки осуществляется путем пассивной диффузии, облегченной диффузии при участии специальных систем переноса, состоящих из белков – переносчиков (пермеаз), и путем активного транспорта при участии специфических пермеаз и затрате энергии в виде молекул АТФ.
Химический состав питательных веществ должен соответствовать химическому составу организма. Химический состав дрожжей приведен в разделе 4.
ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА. УГЛЕВОДЫ
По типу питания дрожжи относятся к гетеротрофным организмам, усваивающим углерод из органических соединений.
Углерод используется для синтеза клеточных компонентов, дыхания и образования вторичных метаболитов.
Источники углерода включают моносахариды, такие, как D-глюкоза, D-манноза, D-фруктоза, D-галактоза, из пентоз – D-ксилоза. Дисахариды сахароза и мальтоза и трисахарид мальтотриоза утилизируются дрожжами, в то время как лактоза (молочный сахар) – нет.
Сахароза гидролизуется инвертазой (β-D-фрукто-фурано-зидазой). Обнаружены две основные формы инвертазы, одна репрессируемая, синтез которой ингибируется глюкозой (она локализована в ППП). Вторая лишена углеводной части, расположена внутри клетки, и ее синтез протекает независимо от содержания глюкозы в среде.
Под действием инвертазы сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, которые поступают в клетку (рис. 6.1). Транспорт облегчается благодаря ферменту переносчику (пермеазе), который находится в цитоплазматической мембране. Скорость переноса глюкозы в клетку при участии пермеазы в миллион раз быстрее, чем это могло бы произойти путем простой диффузии через мембрану.
Мальтоза сначала поступает в клетку при участии специфических индуцибильных пермеаз. И только в клетке происходит гидролиз этого дисахарида ферментом α-глюкозидаза (мальтаза), который индуцируется одновременно с пермеазами и гидролизует мальтозу до глюкозы внутри клетки. По такой же схеме происходит потребление трисахарида мальтотриозы (см. рис. 6.1).
Трисахарид раффиноза в зависимости от штаммовых особенностей дрожжей либо сбраживается полностью (штаммы пивных дрожжей низового брожения), либо на 1/3 (пекарские дрожжи и пивные дрожжи верхового брожения).
Присутствующие в питательной среде глюкоза, фруктоза и са-хароза используются дрожжами в первую очередь, затем потребляется мальтоза и далее мальтотриоза, олигосахариды с числом гликозидных остатков более трех и декстрины дрожжами не утилизируются (рис. 6.2).
Такие органические соединения, как глицерин, этанол и лактат, не сбраживаются, но в аэробных условиях ассимилируются дрожжами.
ИСТОЧНИКИ АЗОТА
Содержание азота в клетках может достигать 10 % на СВ. Источниками азота для синтеза белка являются ионы аммония и аминокислоты. Однако рост клеток происходит быстрее, если в питательной среде содержатся аминокислоты, а не ионы аммония. Аминокислоты в процессе брожения потребляются последовательно. Это определяется свойствами и специфичностью пермеаз, локализованных в клеточной мембране дрожжей. Большинство поступающих в клетку аминокислот сначала подвергается действию трансаминаз, отщепляющих аминогруппы, при этом остается углеводный скелет, который далее метаболизируется.
Дрожжи не могут ассимилировать азот из органических соединений (кроме мочевины), нитратов и нитритов.
В дрожжевой промышленности и в виноделии в качестве источника азотного питания используют сульфат аммония (ГОСТ 10873–73), диаммонийфосфат марок А и Б (ГОСТ 8515–75) и раствор аммиака (ГОСТ 9–77). Очень редко в качестве источника азотного питания используется мочевина (ГОСТ 2081–75).
МИНЕРАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ. МАКРО И МИКРОЭЛЕМЕНТЫ
Активность некоторых ферментов может зависеть только от структуры самого белка, для других требуется также присутствие определенных групп небелковой природы – кофакторов. В роли кофакторов могут выступать ионы металлов или сложные органиче-ские соединения, называемые коферментами. Иногда для проявления активности фермента необходимо присутствие как тех, так и других.
Ниже приведены сведения о некоторых ферментах, коферментами в которых являются ионы металлов:
Zn+2 – кофермент алкогольдегидрогеназы, карбоксипептидазы;
Mg+2 – кофермент пируватфосфокиназы, фосфогидролазы и фосфотрансферазы;
Mn+2 – кофермент фосфотрансферазы;
Fe+2 и Fe+3 – коферменты каталазы, пероксидазы и цитохромов;
Cu+2 и Cu+ – коферменты тирозиназы и цитохромоксидазы;
K+ – кофермент пируватфосфокиназы;
Na+ – кофермент плазматической АТФ-азы.
МАКРОЭЛЕМЕНТЫ
К макроэлементам относятся фосфор, калий, магний, натрий и сера.
Потребность дрожжей в фосфоре.
Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, АТФ, фосфолипидов, полимеров клеточной стенки, в мембраны органоидов клеток. Он способствует поддержа-нию буферности, препятствующей сдвигу рН в цитоплазме клеток. Нехватка фосфора проявляется в замедлении скорости брожения и роста клеток.
Количество P2O5 в клетках определяется условиями культиви-рования, содержанием солей фосфора в среде и может достигать 5,5 % от СВ дрожжей.
Потребность дрожжей в калии.
В хлебопекарных дрожжах содержание калия в пересчете на K2O в пределах от 1,4 до 4,3 % от АСБ, в пивных дрожжах – в среднем 2,4 % от СВ. 68
Калий активирует около 40 различных ферментов, в том числе оксидазы и дегидрогеназы. Ионы калия выполняют роль не только коферментов, но также входят в состав некоторых структур клетки, в частности, рибосом. Калий также участвует в регуляции транспорта ионов через клеточную стенку и через митохондриальную мембрану. В связи с увеличением скорости роста дрожжей потребность в калии увеличивается.
Ионы К+ определяют транспорт в клетки ортофосфата, играющего большую роль в энергетическом обмене дрожжей. Скорость этого процесса зависит как от вида микроорганизма, так и от условий культивирования. При энергетическом обмене, стимулируемом глю-козой, экзогенный калий поступает в клетку одновременно с фосфатом, при этом происходит отток ионов Н+ из дрожжей. Этот процесс является энергозависимым и происходит при участии фермента АТФ-азы.
Следует обратить внимание на обмен ионов К+ и Н+ через митохондриальную мембрану. В данном случае, помимо К+, в этом обмене участвуют также ионы Nа+ и ионы двухвалентных металлов Ca+2, Mn+2 и Sr+2. Переход этих ионов в митохондрию сопровождается выбросом эквивалентного количества Н+.
Для дрожжей экономический коэффициент по калию равен 54. Это означает, что 1 г элемента входит в состав 54 г АСБ.
Потребность дрожжей в магнии.
Магний необходим как для энергетического, так и конструктивного обмена дрожжей, так как он является кофактором многих ферментов (см. раздел 5). Он стимули-рует утилизацию мальтозы и мальтотриозы.
Экономический коэффициент в расчете на ионы потребленного магния составляет 540 г сухой биомассы на 1 г магния и обратно пропорционален количеству РНК в биомассе.
При составлении питательных сред следует учесть следующее соотношение между макроэлементами в пересчете на их оксиды: MgO:K2O:P2O5, которое равняется 1:10:20.
Потребность дрожжей в сере.
Сера необходима, главным образом, для синтеза серосодержащих аминокислот цистеина и метионина. Кроме того, небольшое количество серы требуется для образо-вания сульфогрупп в некоторых коферментах, таких как биотин, кофермент А, липоевая кислота, тиамин и пиридоксин.
Было установлено, что в дрожжах при недостатке этого компо-нента в среде культивирования наблюдается снижение дыхательной активности клеток, как и при ингибировании роста дрожжей недостатком железа. Сера усваивается дрожжами из неорганических сульфатов, из серосодержащих аминокислот. Экономический коэффици-ент в расчете на ионы SО4-2 для пекарских дрожжей составляет 100 г сухой биомассы на 1 г.
МИКРОЭЛЕМЕНТЫ
Микроэлементы участвуют в метаболизме дрожжей и влияют на их химический состав, рост и размножение. К микроэлементам, которые в первую очередь необходимы для роста дрожжей, относятся Zn, Cu, Ca, Mn, Fe, Co. Элементы, редко требуемые для роста: B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, I.
В связи с тем что многие питательные ингредиенты среды также могут содержать микроэлементы и их количество не учитывается в расчете экономического коэффициента, данные, приведенные в табл. 6.1, приблизительны.
Потребность в микроэлементах может увеличиваться в несколько раз, когда культура испытывает стресс, например, при увеличении температуры выше оптимальной.
Микроэлементы могут накапливаться в клетках при культивировании их в среде с высокой концентрацией элементов. Так, биосорбция цинка в среде содержащей 0,8 мг Zn+2/мл, составляет 52,5 мг/г СВ.
Цинк входит в состав около 70 ферментов дрожжей. Он является кофактором ферментов клеточной стенки, стимулирует дыхательный метаболизм дрожжей, биосинтез белка, обмен нуклеиновых кислот, углеводов, вследствие этого он влияет на рост и размножение клеток. Ввиду участия цинка в высвобождении глюкозы (в виде гл-1-Ф) из гликогена увеличивается стрессоустойчивость дрожжей при их внесении в плотные питательные среды, в результате чего сокращается длительность лаг-фазы роста клеток.
В связи с тем что солодовое сусло, которое используется в технологии как хлебопекарных, так и пивных и спиртовых дрожжей, содержит недостаточное количество солей цинка, следует обратить внимание на факторы, влияющие на концентрацию этого микроэле-мента в солоде, используемом для приготовления сусла. На содержание цинка в сусле влияют:
– степень растворения солода. Чем выше степень растворения солода, тем выше содержание цинка в горячем охмеленном сусле (без дробины);
– температура затирания. При 50 °С количество растворимого в сусле цинка больше, чем при затирании солода при 60 °С;
– гидромодуль затора. Жидкие заторы приводят к увеличению содержания цинка в сусле;
– рН затора. Биологическое подкисление способствует увеличению растворимости цинка.
Содержание ионов цинка в клетках должно быть на уровне 6 мг/100 г. Для получения этого количества в сусле должно содержаться не менее 0,08 мг цинка в литре. Ввиду того что цинк может аккумулироваться в клетках, дополнительное внесение этого элемента на этапе получения посевного материала гарантирует хорошие результаты при последующем размножении дрожжей в бедных питательных средах.
Расчет дополнительного внесения цинка можно сделать исходя из того, что экономический коэффициент для него составляет приблизительно 20 мг/г АСБ дрожжей (см. табл.6.1), или для прироста 100 г АСБ требуется 0,005 г цинка.
Медь является коферментом оксидаз и влияет на дыхательный метаболизм дрожжей. Коферментами пептидаз могут являться ионы меди или ионы цинка.
Экономический коэффициент прироста биомассы в расчете на медь составляет 100 кг АСБ/г, т.е. для прироста 100 г АСБ требуется 0,001 г меди.
Марганец активизирует целый ряд ферментов: декарбоксилазы, дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы, пептидазы, киназу. Вместе с железом, цинком и молибденом ионы марганца могут нивелировать вредное действие меди. Этот микроэлемент стимулирует процесс брожения даже в том случае, когда в сусле содержится недостаточное количество ионов цинка. Для биосинтеза 100 г АСБ требуется 0,005 г Mn+2.
ФАКТОРЫ РОСТА ДРОЖЖЕЙ
Помимо элементов минерального питания, источников углерода и кислорода дрожжи нуждаются в некоторых дополнительных веществах, называемых факторами роста, или ростовыми веществами.
Организмы, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксо-трофными. Им противопоставляют организмы, которые не зависят от факторов роста, – это прототрофы.
К факторам роста относятся такие соединения, как аминокислоты, пурины и пиримидины, а также витамины. Аминокислоты, пурины и пиримидины – составные части белков и нуклеиновых кислот; витамины входят в состав коферментов, как правило, это простетиче-ские группы фермента, т.е. коферменты, прочно связанные с ферментом.
В состав коферметов дрожжей входят многие витамины группы В, а также не относящаяся к витаминам липоевая кислота.
Витамины по растворимости можно объединить в две группы – водорастворимые и жирорастворимые. Водорастворимые: В1, В2, В3, В5, В7, В8, В9, В12, С; жирорастворимые: А, D, Е, К.
Витамин В8 (инозит, или мезоинозит, для дрожжей) не относит-ся к витаминам, хотя его роль и очень велика в росте и размножении клеток.
В метаболизме дрожжей не участвуют витамины С и В12, дрожжи также не нуждаются в жирорастворимых витаминах.
Рост в отсутствие витаминов указывает на тот факт, что витамин синтезируется самими клетками.
В табл. 6.3 указано количественное содержание витаминов в дрожжах.
Рассмотрим роль отдельных витаминов, представляющих наибольший интерес с точки зрения влияния на дыхательный и бродильный метаболизм дрожжей S.cerevisiae.
ВИТАМИНЫ В МЕТАБОЛИЗМЕ ДРОЖЖЕЙ
Аэробный метаболизм дрожжей, при котором имеет место максимальное накопление биомассы и отсутствие синтеза этилового спирта, не может протекать в отсутствие или недостатке таких витаминов, как В1, В2, В7 и В8. Эти же витамины необходимы дрожжам в условиях брожения, когда часть глюкозы идет на синтез биомассы, а другая часть – на образование спирта и других продуктов брожения.
Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы и играет положительную роль в процессах, связанных с образованием спирта. Вместе с тем этот витамин необходим в аэробном метаболизме дрожжей. Это связано с тем, что он входит в состав пируваткарбок-силазного комплекса, который контролирует синтез ацетил-S-КоА, исходного компонента дыхательного метаболизма дрожжей. Кроме того, тиамин необходим для работы ЦТК, он является одним из факторов, способствующих замыканию этого цикла, т.е. превращения 2-оксоглутарата в сукцинат, благодаря чему возможен аэробный обмен у дрожжей и высокий выход энергии, необходимой для синтеза биомассы.
Пантотеновая кислота (В3) входит в состав Ко-А-SН (кофер-мента ацелирования). Этот кофермент участвует во многих ферментативных реакциях, в которые вовлечены не только ацетильные, но и любые другие ацильные группы, при этом Ко-А-SH выполняет функции промежуточного переносчика ацильных групп. Большинство штаммов пекарских, винных и пивных дрожжей являются ауксо-трофами по витамину В3.
