Оценка плотности клеточной популяции и жизнеспособности клеток играет фундаментальную роль в цитологических исследованиях, начиная с исследований экосистем и заканчивая анализом пролиферации.
Методы анализа жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток определяется их способностью поддерживать состояние, необходимое для выполнения специфических функций, а также их митотическим потенциалом. Для её определения существуют множество различных методов анализа жизнеспособности клеток, из них наиболее распространенные можно разделить на следующие группы:
1) оценка морфологии клеток при помощи витальных красителей;
2) оценка активности внутриклеточных ферментов:
- определение митохондриальной активности клеток (MTT-тест), основанное на реакции восстановления (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Нтетразолиум бромида (МТТ) клеточными оксиредуктазами;
3) специфические тесты, например, определение апоптоза с использованием антител к Аннексину V.
Стандартным методом определения жизнеспособности клеток является оценка их целостности, заключающаяся в окрашивании клеток красителем, проникающим внутрь клетки и связывающимся с внутриклеточными белками, что приводит к окрашиванию клеток в случае повреждения мембраны. Окрашенные клетки обычно считаются нежизнеспособными. Одним из основных красителей, использующиеся в этом методе, является трипановый синий. Также можно использовать флуоресцентные красители, такие как пропидия йодид, DAPI и акридиновый оранжевый.
При ручном анализе для оценки доли погибших клеток относительно общего количества клеток проводят микроскопию в камере Горяева или в гемоцитометре. Однако в настоящее время автоматические счётчики клеток повсеместно вытесняют ручной метод, поскольку они обладают большей точностью, лучшей воспроизводимостью и значительно сокращают время подсчета.
Методы подсчета клеток с использованием автоматических счетчиков
Автоматизированные счетчики клеток используют следующие методы для подсчета клеток:
1) метод прямой визуализации;
2) метод проточной цитометрии;
3) метод электрического импеданса – счетчики Культера.
При выборе прибора для подсчета клеток важно учитывать возможность оценки жизнеспособности клеток. Например, счетчики Культера, основанные на метода электрического импеданса, не позволяют отличить живые клетки от мертвых, поскольку они детектируют изменения электрических импульсов, возникающих при прохождении клеток через электрочувствительную зону апертуры прибора.
Для измерения характеристик отдельных клеток и частиц также можно использовать проточный цитометр. Для этого клетки метят флуоресцентными антителами или окрашивают витальным красителем, после чего проводят подсчет количества событий в гейте живых клеток относительно общего количества событий. Для цитометров подсчет клеток является одной из многих функций прибора, но не самой основной.
Счетчики клеток, работающие по принципу прямой визуализации, позволяют анализировать клетки как в светлом поле, так и проводить флуоресцентную визуализацию клеток при наличии флуоресцентного канала. Для выполнения анализа клетки смешивают с колориметрическими или флуоресцентными красителями и помещают в одноразовый слайд, который гарантирует отсутствие контаминации и воспроизводимость результатов. Счетчики клеток с флуоресцентными каналами для анализа жизнеспособности используют флуоресцентные красители, например, акридиновый оранжевый, пропидий йодид, DAPI и другие. Использование различных флуоресцентных красителей позволяет расширить аналитические возможности прибора и проводить дополнительные эксперименты, такие как анализ экспрессии флуоресцентных белков.
Компания Диаэм представляет новый автоматический счетчик клеток С100, RWD, который является идеальным решением для точного и эффективного анализа жизнеспособности клеток. Прибор имеет множество функций для анализа клеток, включая подсчет количества, анализ жизнеспособности, морфологии и размера. Благодаря системе визуализации высокой четкости и усовершенствованному алгоритму считывания клеток в конгломератах прибор можно использовать для анализа различных видов клеток, включая первичные клеточные культуры и стволовые клетки.
Прибор настраивается в соответствии с потребностями пользователя. Исследователь может самостоятельно определить и установить пороговые значения размера клеток, яркости и округлости для получения более точных результатов.
Автоматический счетчик клеток RWD С100 прошел соответствующие сертификационные процедуры и соответствует требованиям Свода Федеральных Документов Food and Drug Administration (США). Согласно этому документу, счетчики клеток и другие аналогичные приборы должны соответствовать определенным стандартам, чтобы гарантирует их точность и надежность для использования в медицинских лабораториях и обеспечивает полное документирование всех процессов и защиту от манипуляций.
