Бактериофаги – это вирусы, которые являются специфическими паразитами бактерий.
Они были открыты в 1917 г. франко-канадским исследователем Феликсом д’Эррелем. Это открытие позволило использовать бактериофаги для лечения бактериальных инфекций . Считается, что бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную и филогенетически древнюю группу вирусов. Рассчитанное количество фаговых частиц на Земле (10^30-10^31) превышает общее число любых других организмов, включая бактерии.
Существует большое количество морфологических форм бактериофагов. По морфологии различают шесть основных типов бактериофагов:
1-нитевидные фаги с одноцепочечной ДНК,
2-фаги без отростка с одноцепочечной РНК или ДНК,
3-фаги с аналогом отростка с одноцепочечной ДНК,
4-фаги с коротким отростком с двуцепочечной ДНК,
5-фаги с длинным отростком и несокращающимся чехлом с двуцепочечной ДНК,
6- фаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом с двуцепочечной ДНК. Наиболее распространенным является 6 тип.
Строение бактериофага обусловлено его действием на бактериальную клетку. Основными элементами фага являются головка, содержащая нуклеиновую кислоту, и отросток («хвост фага»), который заканчивается базальной пластинкой с зубцами (фибрами) для прикрепления к бактериальной клетке. У некоторых фагов головка может быть покрыта липидным суперкапсидом, отросток может быть окружен сократительной белковой оболочкой (чехлом). Размеры фага в среднем колеблются от 20 до 200 нм (нитевидные фаги – до 800 нм). Химический состав: белков 50-60%, нуклеиновой кислоты – до 40-50%, липидов – до 1,5-3%. Фаги устойчивы к действию физических и химических факторов. Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°-70°С. Они хорошо переносят замораживание и длительно сохраняются при низких температурах и высушивании. Сулема (0,5% раствор), фенол (1% раствор) не оказывают на них инактивирующего действия. В то же время 1% раствор формалина инактивирует фаг через несколько минут. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация также вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах — мутации.
Для проникновения в микробную клетку под чехлом у фагов содержится фермент эндолизин (муреин-гидролаза). Выделяют следующие стадии взаимодействия бактериофагов с бактериальными клетками:
– адсорбция;
– проникновение нуклеиновой кислоты фага в бактерию;
– репродукция бактериофага;
– выход фаговых частиц (для вирулентных фагов) 269 или лизогения (для умеренных фагов).
В результате взаимодействия фагов с бактериальными клетками возможны 2 исхода:
– продуктивная (литическая) инфекция с лизисом бактерии и образованием новых фаговых частиц;
– интегративная инфекция (лизогения) со встраиванием ДНК фага в бактериальный геном и лизогенной конверсией бактериальной клетки. Фаги, способные к продуктивной инфекции и лизису бактерий, являются вирулентными. Фаги, которые способны встраивать свою ДНК в геном бактериальной клетки, являются умеренными.
Бактериофаги широко применяются в различных сферах. Их используют в ветеринарии для профилактики и лечения бактериальных заболеваний животных, в генной инженерии для трансдукции, в качестве векторов, в пищевой промышленности для обработки продукции, в сельском хозяйстве для защиты растений и защиты скота от заболеваний, в экологии для очистки помещений, санитарной обработки, проведения экологических мероприятий.
Несмотря на все положительные свойства бактериофага существует проблема возникновения бактериофагии на биотехнологических предприятиях. Если производственные культуры будут заражены соответствующим фагом, то технология производства нарушится. Поражение фагом производственных культур ведет к ослаблению производственного процесса вплоть до полной его остановки, причем борьба с фагом в таких условиях бывает очень тяжелой. В таких случаях необходимо пользоваться фагоустойчивыми штаммами.
Отрицательное влияние бактериофагов на штаммы бактерий выявлено давно. В монографии С. Прескота и С.Дэна (1952 г.) описывается влияние бактериофага на различные штаммы B.Polymyxa, которые являются продуцентами 2,3-бутиленгликоля. При изучении было установлено, что при нагревании в течении 30 минут при 55 градусах бактериофаг инактивировался, но при этом в некоторых случаях бактериофаг может распространяться бактериальными спорами. В одном из опытов нагревание в течении 60 минут при 80 градусах не инактивировала бактериофаг. Для предотвращения действия бактериофага на производственные культуры автор опыта рекомендовал производить стерилизацию аппаратуры, соблюдать стерильность, тщательно проверять культуру на наличие бактериофага. Также можно готовить посевной материал из смеси штаммов.
Бактериофаги оказывают значительное влияние на промышленное производство молочных продуктов. При производстве кисломолочных продуктов наибольшее значение имеют фаги, поражающие мезофильные молочнокислые стрептококки: Lac. lactis, Lac. diacetylactis, Lac. cremoris. Обнаружены бактериофаги, поражающие Str. thermophilus и молочнокислые палочки. Однако среди этих микроорганизмов бактериофаги встречаются очень редко. Благоприятные условия для размножения фагов находятся в диапазоне температур от 8 до 46 °С. Основными условиями, способствующими размножению бактериофага, являются непрерывное ведение технологического процесса, кислая реакция среды, добавление СаС12, разбрызгивание сыворотки, перемешивание. Основными условиями, подавляющими развитие бактериофага, служат внесение в молоко сычужного фермента, обработка оборудования УФ-лучами, раствором хлорной извести или другими моюще-дезинфицирующими растворами. Лизогенные штаммы молочнокислых бактерий являются основным источником попадания профагов в производственные закваски, которые в дальнейшем размножаются в микрофлоре полуфабрикатов, продуктов, оборудования, молочной сыворотки и др.
Для борьбы с бактериофагами чаще применяют асептическое выращивание заквасок, частую смену штаммов бактерий в закваске, использование питательных сред, тормозящих деятельность фагов, и др. 270 Асептическое изготовление заквасок предусматривает абсолютную стерильность, достаточно высокое нагревание молока (не меньше 90 °С), тщательную мойку и дезинфекцию всех установок для производства заквасок. Закваски необходимо использовать в течение нескольких дней, а затем применять другую закваску с очень похожими свойствами. Для смены необходимо иметь от 3 до 8 заквасок. Применение питательных сред, подавляющих развитие бактериофага, основано на том, что адсорбция фагов зависит от присутствия кальция. При использовании свободных от кальция питательных сред можно значительно уменьшить адсорбцию бактериофагов на клетках хозяина. Это объясняется тем, что частицы фага и бактерии имеют одинаковый отрицательный электрический заряд и в отсутствие ионов кальция они взаимно отталкиваются, так как ионы Са2+ сообщают клетке положительный заряд. В питательную среду можно добавлять, так называемое, иммунное молоко, т. е. молоко, полученное от коров, иммунизированных бактериофагами, и содержащее специфические противофаговые антитела. Кроме того, необходимо осуществлять мойку, дезинфекцию и другие санитарногигиенические мероприятия, уменьшающие загрязнение производственных помещений и оборудования бактериофагами.
Широко распространена проблема бактериофагии при производстве сыров. Многолетняя практика сыроделия показывает, что наиболее распространенным ингибирующим фактором, приводящим к снижению активности микрофлоры заквасок, в 80- 90% случаев является фаголизис составляющих её бактериальных клеток. Установлено, что бактерии практически каждого из известных видов являются хозяином одного или нескольких штаммов бактериофаг. Установлено, что на сыродельных предприятиях распространены фаги, активные в отношении практически всех видов молочнокислых бактерий (мезофильных и термофильных лактококков, термофильных стрептококков и термофильных палочек). Спектр литической активности бактериофагов детерминируется геномом фага, наличием клеток бактериальных хозяев, гетерогенностью их клеточных популяций и географической локализацией предприятий. В частности, результаты исследований литической активности фагов на предприятиях Алтайского края показали приоритет распространенности фагов, лизирующих клетки Lactococcus lactis subsp. lactis и меньшую распространенность фагов, лизирующих культуры Lactococcus lactis subsp. cremoris или Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis по сравнению с европейской частью страны.
Определить наличие бактериофагов на молочном производстве можно по следующим признакам:
-Торможение времени сквашивания. Сначала на полчаса, при последующих выработках время удлиняется.
-Набор кислотности скачками. Есть замедление при 45-55 °Т, затем опять рост.
-Искажение вкусовых и структурных качеств готового продукта.
-Полное отсутствие работы закваски.
В настоящее время сформулированы следующие «антифаговые» принципы подбора производственных штаммов для бактериальных заквасок для сыров: - штаммы, входящие в состав заквасок, должны быть устойчивы к коллекционным фагам или могут быть чувствительны к возможно наименьшему их количеству и различаться по фаготипу (набору фагов, лизирующих данную культуру);
- в последнем случае приоритет отдается культурам лишь с определенными характеристиками литического цикла системы фаг-хозяин (наименьшие скорость адсорбции, и выход вирионов, наибольшая длительность латентного периода);
- штаммы соседствующих по времени использования партий заквасок должны отличаться по фаготипу;
- лизогенные или обладающие антагонистической активностью культуры не должны использоваться в составе заквасок.
Технология борьбы с бактериофагами, принятая в нашей стране, не лишена недостатков. В частности, она требует наличия в обороте огромного числа штаммов молочнокислых бактерий (для многоштаммовых заквасок). Причем ротация заквасок предполагает постоянное пополнение фонда используемых микроорганизмов и зачастую не позволяет эффективно применять особо ценные штаммы, на селекцию которых подчас затрачивается значительное количество труда и средств. Кроме того, многоштаммовость закваски не гарантирует ее неуязвимости в отношении фаголизиса. Наконец, многократное использование оборудования в течение дня способствует обсеменению производства всевозрастающим количеством фагочастиц, что увеличивает вероятность появления высоковирулентных мутантов фагов и расширения спектра их литического действия . Бактериофаги — одна из самых серьезных технологических угроз для современной молочной промышленности. Постоянное увеличение производственных мощностей вызывает проблему бактериофагов, которая со временем будет становиться все более острой. Если не уделять достаточного внимания управлению уровнем фага, то последствия могут быть очень серьезными. Вовремя принятые меры могут свести риск серьезного ущерба от фаговой атаки к минимуму.
