В первой статье спецпроекта мы уже обсудили методы ChIP-секвенирования и Dam-метилирования, которые позволяют воссоздать профиль связывания белка с ДНК. Теперь давайте обсудим метод, который позволяет увидеть хроматиновый домен, отмеченный каким-нибудь специфическим белком, под флуоресцентным микроскопом. Метод называют иммунофлуоресценцией (рис. 1).
1 — Сначала клетки фиксируют формальдегидом, и соседние молекулы ковалентно сшиваются вместе. 2 — Затем мембраны клеток «дырявят» каким-нибудь детергентом, позволяя веществам проходить сквозь нее. 3 — Затем, чтобы уменьшить неспецифическое связывание антител с белками, добавляют специальный блокирующий раствор, молекулы которого связываются со всеми белками и уменьшают подобные взаимодействия антител. 4 — Затем клетки инкубируют с антителом против интересующего нас белка, а затем (5) со вторым антителом, которое связывается с первым и несет флуоресцентную метку. Вуаля (6): наш хроматиновый домен можно увидеть под флуоресцентным микроскопом!
Иногда у белка в ядре есть две фракции: плотно связанная с хроматином и «свободно плавающая» по ядру (такая ситуация с уже известным нам белком HP1a в ядре клеток дрозофилы). Чтобы четче увидеть хроматиновые домены, при иммунофлуоресценции перед фиксацией клеток добавляют липидный детергент, «дырявящий» мембрану: так неплотно связанные с хроматином молекулы уплывут из клетки через поры в мембране, а связанные останутся. Так, например, можно четко увидеть гетерохроматиновые домены у мушек, помеченные HP1a (рис. 2).
Как светятся флуоресцентные метки?
Они могут поглощать свет определенной длины волны и переизлучать более длинноволновый свет (это и называется флуоресценцией). Интересно, что некоторые белки тоже обладают свойствами флуорофоров: самые известные из них — это зеленый, красный и другие флуоресцентные белки (GFP, RFP и т.д.), выделенные в свое время из медуз и кораллов и усовершенствованные биотехнологически. Ген GFP (или RFP) часто привязывают к гену изучаемого белка: таким образом место расположения изучаемого белка будет светиться под флуоресцентным микроскопом зеленым или красным светом.