Полимеразная цепная реакия (ПЦР) - это техника, которая используется для увеличения количесва копий определенного (необходимого нам) участка ДНК.
Ключевые моменты:
• ПЦР используется для получения большого количества (множества) копий специфического участка днк in vitro;
• Для ПЦР необходимы термостабильная ДНК полимераза - Taq-полимераза, а также ДНК-праймер, который "сделан" специально под интересующий нас участок ДНК;
• Target - намеченный, целевой, участок интереса. В ПЦР реакция повторяется несколько раз от начала до конца, проходя через температурные изменения, что позволяет произвести много копий целевого региона интересующей нас ДНК;
• У ПЦР множество применений: ДНК клонирование, медицинская диагностика, судебный анализ ДНК.
Что такое ПЦР?
ПЦР - это стандартная лабораторная технология, которая используется для производства множества копий (миллионов и миллиардов!) отдельного конкретного участка ДНК. Этот участок ДНК может быть любым. Например, это может быть ген, функцию которого надо выяснить, или генетический маркер, который нужен судебным экспертам для установления подозреваемых.
В общем, цель ПЦР - "наштамповать" достаточное количество копий интересного нам участка ДНК для дальнейшего анализа или применения. После ПЦР ДНК можно направить на секвенирование, электрофорез или дальнейшие эксперименты.
Области применения ПЦР: биология, молекулярные исследования, медицинская диагностика, даже экология.
Taq-полимераза
Как и для репликации ДНК в организме, для ПЦР необходима полимераза, которая делает новую нить ДНК по шаблону уже существующей, то есть строит комплементарную матричной цепь ДНК.
ДНКполимераза для ПЦР должна быть теплоустойчивой, поэтому используют полимеразу термостабильной бактерии - Thermus aquaticus. Отсюда название - Taq-полимераза. Она может начинать синтез только от 3ˊ-конца праймера.
Т. aquaticus живет в горячих источниках. Ее ДНК-полимераза отлично переносит высокие температуры и наиболее активна при 70°C. К слову, ДНК полимераза E.Coli при таких температурах инактивируется. Это свойство делает Taq-полимеразу идеальной для ПЦР. Как мы увидим далее, высокие температуры используются в ПЦР по несколько раз, чтобы разрушить шаблонную ДНК или разделить нити ДНК.
Праймеры
Как и другие ДНК полимеразы, Taq-полимераза может действовать только при наличии праймера — короткой последовательности нуклеотидов, которая является стартовой (отправной) точкой синтеза ДНК.
Праймер в ПЦР - это короткая искусственно синтезированная цепочка нуклеотидов, комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров есть 3ˊ- и 5ˊ-концы. В каждой ПЦР используется 2 праймера, они примыкают к целевому региону (регион, который нужно скопировать).
Когда праймеры присоединяются к матрице, они удлиняются с помощью полимеразы, и область, которая находится между ними, будет скопирована.
Этапы ПЦР
Главными ингредиентами ПЦР являются Taq-полимераза, праймеры, ДНК-матрица и нуклеотиды (строительный материал ДНК). Все они собираются в пробирку вместе с кофакторами, необходимыми для фермента, и проходят через повторяющиеся циклы нагревания и охлаждения, которые позволяют синтезировать ДНК.
Основными этапами ПЦР являются:
- Денатурация (96°С): Нагревание реакции для разделения цепей ДНК (разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей), чтобы получилась одноцепочная ДНК для следующего шага.
- Отжиг праймеров (40-72°С): Остужение реакции, чтобы праймеры смогли присоединиться к комплементарным последовательностям одноцепочной ДНК. Отжиг - это комплементарное связывание.
- Удлинение/Элонгация/Синтез ДНК (72°С): Увеличение температуры реакции до 72°С, чтобы Taq-полимераза смогла удлинить праймер, синтезируя новую цепь ДНК. Taq-полимераза последовательно выстраивает цепь ДНК (полимер) из нуклеотидов (мономеров), то есть полимеризует их.
Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится матрицей для синтеза в следующем цикле, наравне со старой цепью.
Этот цикл повторяется множество раз в стандартной ПЦР, которая обычно занимает 2-4 часа в зависимости от длины копируемой части (региона) ДНК. Если реакция идет без сбоев, то количество копий целевого участка ДНК может достичь миллиарда.
Каждая новая копия становится матрицей для следующих копий. В реакции участвует много копий праймеров и молекул Taq-полимеразы, поэтому количество вновь синтезированных молекул ДНК практически удваивается в каждом цикле. Наглядно этот процесс показан на картинке ниже ⬇️
Использование гель-электрофореза для визуализации результатов ПЦР
Для того, чтобы увидеть результат ПЦР применяют гель-электрофорез. Гель-электрофорез - это техника, в которой фрагменты ДНК проводят через гелевую матрицу под электрическим током, что позволяет "расфасовать" кусочки ДНК по размерам.
Благодаря отрицательно заряженному сахарофосфатному остову ДНК, фрагменты движутся в геле под действием электрического поля от отрицательного катода к положительному аноду . Чем короче молекула, тем быстрее она движется.
Фрагменты ДНК одинаковой длины образуют «полосу» на геле, которая видна невооруженным глазом, если гель окрашен ДНК-связывающим красителем. Реакция ПЦР с получением какого-либо количества фрагментов пар оснований будет выглядеть таким образом: