Проточный цитометр 7S имеет 5 детекторов (FL1-FL5), включая основание FSC, SSC. Детекторы прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния представляют собой фотодиоды. Одновременное измерение прямого и бокового светорассеяния без окраски клеток крови флуоресцентными красителями, позволяет, выделит все клеточные популяции лейкоцитов. Пять детекторов (FL1-FL5) собирают сигналы флуоресценции: FL1: 525/50 (FITC - флуоресцеин изотиоцианат, которое используется в широком спектре приложений, включая проточную цитометрию), FL2: 585/40 (фикоэритрин PE- фикоэритрин), FL3: 630/30 (PE-Texas Red/ECD/PI), FL4: 697/60 (PerCP (белок хлорофилла – перидин-хлорофилл протеин) , PE-Cy5 (Тандем цианин-5/фикоэритрин ) / PE-Cy5.5), FL5: 780/60 (PE-Cy7).
Цель работы
1) Показать адекватности полученных результатов на стандартном образце крови здорового человека проточном цитометром 7S.
2) Показать способность анализировать, идентифицировать отдельные классы, подклассы, популяций, субпопуляций клеток крови путем измерения их поверхностных и/или внутриклеточных маркеров проточном цитометром 7S.
Материал и методы
Для выполнения работы использовали кров здорового человека которая хранилась в пробирках с ЭДТА K3 на комнатной температуре. Лизис буфер, фосфатно-солевой буфер (PBS) и флуоресцентно меченая антитела от производителя BioSino. Одноразовые пробирки 12 × 75 мм, (микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, 2 мл) и вортекс. Подготовку образца проводили по стандартной методике.
Результаты
Анализ основных популяций периферической крови человека В-лимфоциты, Т-лимфоциты, Натуральные киллеры", Т-цитотоксические лимфоциты (Т-ЦТЛ).
Рисунок 1. Иммунофенотипирование клеток, осуществлено с помощью проточного цитофлуориметра, 1 лазер, до 5 флуоресцентных каналов, 7S, BioSino.
На картине представлено иммунофенотипирование лимфоцитов крови человека. Выделены популяции: В-лимфоциты, T-лимфоциты, Т-"натуральные киллеры"(НК-Т), "Натуральные киллеры" НК.
а) На первом рисунке дот-плот показаны клетки здоровой неокрашенной периферической крови с установленным порогом threshold по прямому светорассеянию. Четко видно разделение всех популяции: лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Клетки внутри ворота (гейтирование) дополнительно анализированы на экспрессию маркеров CD19PECy7, CD3PECy5, CD16FITC, CD56FITC.
б) Разделение популяции Т и B лимфоцитов по маркерам CD3PECy5 и CD19PECy7.
в) Разделение популяции NK-клеток по маркерам CD16FITC/ CD56FITC и Т-цитотоксических лимфоцитов (Натуральные Т-клетки-киллеры (Т-NK)) по маркерам CD3 PECy5, CD16 FITC, CD56 FITC.
Заключение
На основании результатов данного исследования можно сделать вывод о том, что проточный цитометр 7S с реагентами одного и тоже производителя BioSino обеспечивают точные результаты при анализе популяций T-, B- и NK-лимфоцитов в образцах крови здоровых людей, собранных в пробирки с ЭДТА K3 и хранившихся при комнатной температуре до 24 часов.
