Блоттинг – популярный, но довольно многоэтапный, а поэтому не всегда простой метод в лабораторной практике. На вебинаре 27 сентября 2022 г. в рамках «Лектория Диаэм» старший специалист-консультант компании Анастасия Веткина (г. Казань) рассказала о приборах и реагентах для каждого этапа метода, познакомила слушателей с новинками и путями, помогающими сделать эксперимент приятней и проще. В целом осенний «марафон» лабораторных вебинаров «Диаэм» посвящен обзору ситуации на рынке, актуальным брендам, новинкам и комплексным решениям в каждой области исследований, которые может предложить своим клиентам компания.
Если говорить об оборудовании и реагентах для белкового электрофореза и вестерн-блоттинга, в настоящий момент «Диаэм» предлагает различные реагенты, буферы, мембраны для переноса, гели, белковые маркеры (стандарты молекулярных масс).
В этом обзоре основное внимание уделено приборам и реагентам для белкового электрофореза и вестерн-блоттинга.
Оборудование Wix для электрофореза и блоттинга
Для более наглядной демонстрации характеристик нового оборудования здесь и далее показаны в сравнении приборы привычных исследователям брендов (главным образом Bio-Rad) справа и аналогов от китайского производителя WIX слева. Обратите внимание: продукцию на слайде с меткой «склад» компания «Диаэм» поддерживает на складе.
Например, всем известная камера Mini Protean Tetra от Bio-Rad и камера WIX-miniPRO4 8.3x7.3 см китайского производителя WIX не зря размещены на одном слайде, поскольку в целом по техническим характеристикам эти приборы равны.
Китайский производитель также предлагает четыре заливочных столика для четырех мини-гелей. Размер у них, как и в случае с камерой от Bio-Rad, составляет 83х73 мм. В комплекте идут гребенки на 10 и 15 лунок, короткие и спейсерные стекла для заливки гелей. Толщина геля в стандартной комплектации 1 мм.
Если нужен более толстый (например, 1.5 мм) или тонкий (0.75 мм) гель, у китайского поставщика тоже можно купить соответствующие гребенки и соответствующие стекла дополнительно к данному набору.
Что касается качества пластика: в камерах используется немецкий поликарбонат, который китайцы импортируют для своих производств.
Из плюсов продукции WIX можно отметить, что все мелкие пластиковые аксессуары этого производителя полностью подходят и для камер Bio-Rad. Тем, кто привык работать с готовыми биорадовскими гелями, можно использовать эти гели для камеры WIX. Такая взаимозаменяемость очень удобна. Стекла от Bio-Rad подходят к китайским приборам, как и гребенки.
То же самое можно сказать об источниках питания для камер WIX: они доступны от того же производителя, но и биорадовские источники тоже подойдут – эти узлы полностью совместимы.
Если говорить о самом блоттинге белков, сравнение соответствующих камер от Bio-Rad и WIX снова будет уместным. Например, сравнение систем мокрого блоттинга Criterion Blotter на 1-4 мини-геля (150х94 мм) и WIX-miniBLOT4 на 1-4 мини-геля (110х90 мм).
WIX предлагает два варианта камер – на два и на четыре геля (на слайде представлен вариант на 4 геля). В комплект входит камера с крышкой и специальные пластиковые зажимы для формирования сэндвичей с губчатыми вставками.
Переходим к обзору источников питания – и вновь сравниваем продукцию всем известного Bio-Rad и китайского WIX.
В таблице приведены примеры наиболее популярных характеристик источников питания PowerPacHC (Bio-Rad) и источника питания WIX-EP3000 для электрофорезной камеры от WIX. Они показывают абсолютную идентичность обоих устройств. Можно и в первом, и во втором случаях подключать 4 геля, электрические характеристики одинаковые (250 В, 3000 мА, 300 Вт), время, которое можно выставить (от 1 мин до 100 ч) – тоже.
Об источнике питания WIX стоит сказать, что он автоматически переставляет вольтаж, когда образцы переходят из концентрирующего геля в разделяющий. В какой-то степени это уменьшает ручной труд: пользователю не нужно отслеживать и переставлять установки системы, она справится с этим сама, ориентируясь на изменяющееся сопротивление.
Этот источник питания может включать режим микродозирования электричества в случаях, когда исследуемые белки уже дошли до нижнего края геля – на случай, если пользователь о них забыл. Чтобы они не диффундировали в гель, прибор дает минимальную дозу электричества, и даже если белки выходят с конца геля, то делают это максимально медленно.
В приборе есть память на 20 программ, что позволяет пользователю сохранять часто используемые установки, не настраивая источник с нуля каждый раз. Это удобно и позволяет сэкономить время.
Всем известна система Trans-Blot Turbo Transfer System от Bio-Rad. И у WIX тоже есть фактически идентичная модель WIX-fastBLOT на две кассеты. На слайде приведена сравнительная характеристика этих систем.
Вместимость у них одинаковая – четыре мини-геля или два миди-геля. Время переноса тоже одинаковое: 2 мини-геля за 3 минуты, 4 мини-геля либо 2 миди-геля – за 7 минут. В обоих случаях есть возможность запускать две независимые программы переноса, потому что и в том, и в другом приборе есть по два лотка.
Различия только в экранах: у Bio-Rad кнопочная панель, у WIX – более продвинутый сенсорный экран.
Среди уникальных позиций, предлагаемых компанией WIX, обязательно нужно упомянуть систему под названием WIX-autoPP. Это своеобразная замена системе iBind, которую предлагал Thermo для автоматической инкубации мембраны. Прибор позволяет в автоматическом режиме проводить несколько этапов, а именно блокировку мембраны – уже после того, как электрофорез закончен и белки в результате вестерн-блота перенесены на мембрану. Этот прибор выполняет в автоматическом режиме загрузку и рециркуляцию различных реагентов, инкубацию с первичными и вторичными антителами и промывку мембран мини-, миди- и макси-формата из нитроцеллюлозы или PVDF.
Система полностью автоматизирована. От пользователя нужно только загрузить нужные буферы в соответствующие контейнеры. Потом система автоматически по мере необходимости будет забирать тот или иной реагент и последовательно проводить автоматически все этапы. По окончании работы все каналы, через которые поступали реагенты, автоматически промываются.
Существенное преимущество этой системы в том, что все вторичные и первичные антитела после того, как они прошли по мембране, собираются в специальные контейнеры, так что их в принципе можно использовать повторно.
Прибор имеет на корпусе экран, на котором последовательно загораются лампочки, которые показывают, какой этап в в настоящее время проходит внутри прибора.
Система позволяет параллельно обрабатывать до 12 вестерн-блот-мембран, так что является хорошим решением для лабораторий с большими потоками.
Еще одно оригинальное решение от WIX – источник питания с регулировкой температуры к камерам для проведения электрофореза Fast Electrophoresis Blot System WIX-coolEB. Источник питания с функцией термостатического циркулятора обеспечивает стабильную мощность, силу тока и напряжение и одновременно эффективно снижает температуру.
Охлаждение камеры нужно, если нежелательно ставить камеру в лед, потому что он тает, или если нет холодной комнаты в лаборатории либо здании.
Это хорошее решение для пользователей, у которых анализируются чувствительные к нагреву белки, а также для случаев, когда процесс разделения идет очень долго и камера успевает нагреться, а затем остается нагретой в течение длительного времени.
С этим источником питания совместимы не все камеры, а только камера для вестерн-блоттинга на 4 минигеля, потому что она имеет специальный кожух, позволяющий источнику питания прикрепляться к этой камере и ее охлаждать. К этому устройству можно подключить до 4 камер.
Камеры Servicebio
Компания Servicebio предлагает две простые модели камеры для вертикального электрофореза на два мини-геля SVE-2 и камеру для вестерн-блоттинга на два сэндвича SVT-2. Обе эти позиции «Диаэм» тоже поддерживает на складе.
Реагенты для работы с белками
В настоящее время в «Диаэм» расширена линейка продуктов. Кроме известного Bio-Rad для работы с белками предлагаются реагенты ряда китайских, индийских, немецких поставщиков, а также реагенты под собственной маркой diaGene.
Реагенты и расходные материалы для электрофореза и блоттинга белков
Наиболее популярные реагенты и расходные материалы, используемые в электрофорезе белков и вестерн-блоттинге, представлены на следующем слайде. В их числе компоненты для самостоятельного приготовления гелей, такие как акриламид в порошке, метилен-бис-акриламид, персульфат аммония, ТЕМЕД для полимеризации полиакриламидного геля и т.д. Доступны также растворы акриламида и бисакриламида, готовые буферы для проведения электрофореза, как с SDS, так и без SDS, компоненты для самостоятельного приготовления этих буферов, буферные растворы для загрузки образцов. Здесь же – различные красители, такие как кумасси R250, G250, серебро, понциановый красный, субстраты для хемилюминесцентной детекции результатов вестерн-блоттинга, а также сухое молоко и бычий сывороточный альбумин для блокировки вестерн-блот-мембран. Кстати, сухое молоко сейчас появилось и от российского производителя.
Реагенты для самостоятельной заливки гелей
В комплекте поставляются несколько баночек, содержимое которых нужно смешать в нужной пропорции, чтобы получить гель в нужной концентрации.
Эта продукция – промежуточное звено между самостоятельной подготовкой к заливке геля (когда пользователь сам должен взвесить и развести порошки, вручную довести pH и заливает гель – здесь этого делать не надо, pH уже доведен до нужного значения) и готовыми гелями. То есть это не готовый гель: нужно сначала смешать компоненты, дождаться полимеризации геля, а после этого можно приступать к загрузке образцов.
Особенность этих комплектов в том, что в них поставляется краситель любого цвета, нужный для окрашивания лунки в концентрирующем геле. Дело в том, что в прозрачные лунки трудно правильно нанести образец: их трудно разглядеть, а потому трудно в них попасть и не пронести образец мимо. Чтобы облегчить задачу, лунки можно окрасить, и они будут более контрастными. Краситель абсолютно инертен, он никак не взаимодействует с белками и не мешает им проходить из концентрирующего геля в разделяющий и разделяться. Он совершенно безопасен для белков и результатов эксперимента.
Комплекты с красителями разного цвета имеют различные каталожные номера: нельзя выбрать комплект и к нему отдельно краситель. Если в такой окрашивании нет необходимости, можно и не добавлять краситель, но в комплекте он присутствует.
Белковые маркеры (стандарты молекулярных масс)
Сейчас на складе «Диаэм» собрано большое количество предокрашенных белковых маркеров от Servicebio – китайского производителя, предлагающего достаточно большую линейку маркеров, в которой есть из чего выбрать. Все они трехцветные, и сейчас на них прогнозируется очень короткий срок поставки, потому что отгрузка будет производиться со склада, а складской запас планируется поддерживать на должном уровне. Кроме того, доступны неокрашенные маркеры от Bio-Rad. Есть и окрашенные, но именно неокрашенные есть только у Bio-Rad, а окрашенные есть в предложении по Servicebio.
Из основных реагентов для работы с белками доступны буферы – лизирующий, IP, RIPA, необходимые для разрушения клеточных лизатов, тканей на первом этапе, когда это требуется для получения белка – для разрушения тканей и используются лизирующие буферы.
Далее следуют коктейли ингибиторов протеаз и фосфатаз, которые блокируют ферменты, разрушающие белок.
Кроме того, на слайде представлены наборы для определения количества белка на основе бычьего сывороточного альбумина.
В ассортименте есть наборы с флюоресцентными красителями и другая продукция от российской компании LumiProbe: набор ProteOrange для определения количества белка, набор QuDye для определения концентрации белка, наборы для мечения белков, для двумерного электрофореза, бифункциональные сшивающие линкеры для сшивки биомолекул.
Следует упомянуть также наборы для экстракции бактериального белка под нашей маркой diaGene.
Они предлагаются в дополнение к реагентам.
Амиконы, которые прежде предлагал Merck Millipore, ранее были очень популярны. Они применяются для обессоливания растворов, концентрирования, удаления праймеров, меток и других низкомолекулярных веществ из смеси, а также фракционирования белков, когда удаляются более низкомолекулярные белки из смеси более высокомолекулярных.
Сейчас такие фильтрующие системы доступны от Cobetter Filtration. Пока этот производитель предлагает пробирки объемом 15 мл, они снабжены мембраной – можно выбрать эту мембрану с различным диаметром пор в соответствии с необходимыми задачами.
Клиенты спрашивают, есть ли фильтрующие шприцевые насадки – да, есть, но складские запасы бывают небольшими, например, на момент проведения вебинара новая поставка только ожидается.
Антитела, наборы для ИФА анализа и реагенты для работы с антителами
Антитела и другие реагенты для ИФА анализа доступны от нескольких производителей – на слайде перечислены наиболее популярные из них. В частности, это Abcam, который «Диаэм» предлагала и ранее. А еще новые игроки этого рынка: Arigobio из Тайваня, ABclonal и Servicebio – из Китая. Все они предлагают первичные антитела для вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, иммуногистохимии, иммуноцитохимии, проточной цитометрии, вторичные антитела, панели антител, у них огромное количество наборов для ИФА анализа, есть рекомбинантные белки, ростовые факторы и цитокины, а также другие реактивы для молекулярной биологии.
Интересна возможность заказа пробников антител от ABclonal в небольшом объеме. Откровенно говоря, антитела ABclonal и Arigobio сейчас намного дешевле, чем известный издавна Abcam. И если есть необходимость попробовать антитело, то у производителя можно запросить пробники, и на каждое антитело производитель даст один пробник объемом 1 мкл. При формировании очередного заказа вместе с остальной продукцией будут заказаны и привезены такие пробники, которые заинтересованный исследователь сможет попробовать, ознакомившись с продукцией нового производителя и не потратив при этом деньги.
Есть еще российский производитель SCI-store, который предлагает небольшое количество антител, и этим предложением можно воспользоваться.
Кроме того, «Диаэм» предлагает антитела для иммуногистохимии.
Рекомбинантные белки для выделения и очистки антител
Это различные ионообменные сорбенты на основе сефарозы CL-4B, на которые пришиты белок А или белок G, обычно используемые в колоночной хроматографии при очистке иммуноглобулинов (и сорбент Антитела кролика к иммуноглобулинам мыши), а также отдельно белок А и белок G, протеаза TEV и конъюгат стрептавидина с полимеризованной пероксидазой, который чаще всего используется для ИФА анализа.
Вопросы по наличию и особенностям продукции можно задать по электронной почте av@dia-m.ru и телефону 8-950-3152723.
