Пониженная регуляция остеопонтина ингибирует потемнение белых жировых тканей через PI3K-AKT путь у мышей C57BL / 6. Продолжение

2.9. Иммуногистохимические анализы

6 мкм парафин-встраиваемые ватные срезы блокировали 5% БСА (бычий сывороточный альбумин) в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы инкубировали с первичными антителами против UCP-1, PRDM16 и PGC-1α в разведении 1:200, в течение ночи при 4 °C. После 3-кратной промывки PBST срезы инкубировали с вторичным антителом (1:4000) в течение 1 ч при комнатной температуре и визуализировали с помощью набора DAB (ZSBIO, Пекин) согласно инструкции производителя. Срезы окончательно наблюдались под микроскопом после окраски гематоксилином.

2.10. Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием Графпада prism версии 5.0. Все экспериментальные данные были выражены как среднее ± S. D. однородность дисперсии и односторонняя ANOVA была использована где соотвествующе. Сравнение между группами проводили с использованием метода ЛСД. Значимым отличием считались значения Р ниже 0,05.

3. Результаты

3.1. Создание тучной модели мыши

Основной задачей этого исследования было сначала установить модель ожирения у мышей. В течение периода моделирования вес тела мышей измеряли каждые две недели. Наши результаты показали, что Весы из группы ГФД (группа ожирения) начали проявлять значительное увеличение на 4-й неделе кормления по сравнению с таковыми из нормальной группы. Кроме того, с увеличением времени гфд-кормления происходит все более значительное увеличение массы тела ( Рис.1). 1 а). В конце 12-недельного кормления индекс ли в группе ГФД был достоверно выше, чем в нормальной группе ( Рис.2). 1Б). Кроме того, фотографии далее показали, что фигура мыши из группы HFD не нормальная группа произошла как ожирение фенотипа ( рис. 1 C), предполагая, что тучная модель мыши была успешно установлена.

1. Создание тучной модели мыши. Тридцать мышей линии C57BL / 6 были рандомизированы в группу высокожировой диеты (HFD) и нормальную группу жратвы (Normal). Мышей из ГФД и нормальной группы кормили с высокожировой диетой и нормальным Чоу в течение 12 недель, соответственно. Во время кормления каждые 2 недели измеряли массу и длину тела и рассчитывали индекс ли. На панели а показаны изменения массы тела в норме и группе ГФД во время моделирования (а). Панель в показывает разницу индекса ли между нормальной и ГФД группой через 12 недель (Б). Панель C показывает изменения в мышиных фигурах нормальной группы и группы HFD после моделирования (C). Данные были выражены в виде среднего ± S. D., n = 15, * * P

3.2. Подтверждение специфичности и таргетирования для Ad-GFP-aP2-OPN-shRNA in vitro

Затем мы попытались исследовать влияние ОПН на потемнение воды у мышей. Для этого мы начали с построения адипозоспецифичного и нацеленного на OPN аденовирусного вектора, содержащего OPN-shRNA (sh-OPN). Чтобы проверить эту векторную адипозид-специфичность и OPN-таргетирование in vitro, аденовирусы, содержащие этот вектор, были трансфицированы в клетки 3t3-L1 (преадипоциты) и HUVEC (сосудистые клетки), и была обнаружена интенсивность флуоресценции GFP и уровни iOPN и sOPN. Как и ожидалось, дневная интенсивность в 3Т3-L1 в клетках сильнее, чем в HUVEC, демонстрируя аденовирусный вектор обладает хорошим жировым-специфичность; кроме того, уровни iOPN и sOPN в ш-ОПН группы заметно снизилась по сравнению с CTRL или группы транспортных средств, с указанием аденовирусного вектора также имеет хорошую ОПН-таргетинга (рис. 2 А–С). Между тем, в естественных условиях результаты были найдены совместимыми с результатами in vitro в WAT как у HFD, так и у нормальных мышей, получавших Чоу ( Рис.2). 2 D и E). В совокупности все эти результаты показали, что Ad-GFP-aP2-OPN-shRNA обладает хорошей адипозной специфичностью и OPN-таргетингом.

2. Подтверждение специфичности и таргетинга для Ad-GFP-aP2-OPN-shRNA. 90% слияния преадипоцитов 3T3-L1 и HUVEC были трансинфицированы либо Ad-GFP-aP2-OPN-shRNA, либо транспортным средством. Через 24 ч транс-инфекции интенсивность флуоресценции GFP визуализировали с помощью флуоресцентного инверсионного микроскопа (а). Преадипоциты 3T3-L1 использовали для определения экспрессии иопн методом вестерн-блоттинга (В), а супернатанты культуры собирали для измерения уровней сопн методом ИФА (с). Кроме того, пятнадцать тучных мышей были случайным образом разделены на три группы: ожирение, ожирение + носитель (пустой аденовирусный вектор) и ожирение + sh-OPN (Ad-GFP-aP2-OPN-shRNA) соответственно. Между тем, 15 нормальных мышей были случайным образом сгруппированы в Ctrl, Vehicle и sh-OPN. После заражения аденовирусом всех животных содержали еще в течение 4 недель и обезболивали, чтобы убить. Уровень экспрессии иопн в Ват определяли методом вестерн-блоттинга (D), а уровень сопн в сыворотке крови-методом ИФА. Данные были выражены в виде среднего ± SD, n = 5, * P < 0,05, * * P < 0,01, по сравнению с контрольной группой; # # P Масштабная линейка: 100 мкм.