Ученые Токийского технологического института (Tokyo Tech) демонстрируют новый подход в флуоресцентной микроскопии, который может быть использован для локализации отдельных биомолекул в 3D пространстве с нанометрической точностью.
Виды микроскопии в науке
Невозможно понять жизнь, не имея четкого представления о микроскопических взаимодействиях между молекулами, которые происходят в клетках и вокруг них.
Микроскопы были и остаются бесценным инструментом для исследователей в этом отношении, и существует множество различных типов микроскопов и методов микроскопии. Соответственно, эти различные методы служат разным целям и имеют свои преимущества и недостатки.
В биологии и медицине, в частности, исследователи ищут методы микроскопии для получения трехмерной информации о расположении и ориентации отдельных молекул в клетках в нанометрическом масштабе.
Одним из возможных подходов для достижения этого является криогенная (т.е. при экстремально низких температурах) электронная томография.
Однако этот метод не может быть использован для наблюдения за внутренним пространством клеток и ограничивается тонкими срезами, извлеченными из пробоотборной клетки, что не так полезно, как возможность локализации молекул непосредственно в соединенныхм клетках.
Для получения более полезных измерений видимый свет может быть использован для освещения специальных образцов в так называемой флуоресцентной микроскопии.
При использовании этого метода целевые молекулы маркируются "флюорофорами", представляющими собой крошечные молекулы, поглощающие энергию света определенного цвета (частоты) и затем повторно излучающие ее путем свечения.
Хотя этот подход оказался полезным для локализации отдельных флюорофоров в плоскости XY (плоская поверхность), значимая 3D локализация биомолекул требует большей точности в Z-направлении или глубине, чем это возможно в настоящее время.
Новые технологии: Крио-флуоресцентная микроскопия
Именно поэтому команда исследователей из Токио Технологии, Нагойского университета и Киотского университета, глубоко погрузилась в крио-флуоресцентную микроскопию, чтобы получить представление об источниках ошибок при таких измерениях и путях их исправления.
В качестве образцов было использованы молекулы ДНК известной длины (10 нанометров) с различными флюорофорами на каждом конце.
Первоначально, после получения изображений обоих флюорофоров и определения расстояния между ними, чтобы увидеть, соответствует ли оно длине молекул ДНК, наблюдалась значительная ошибка в их измерениях.
Это было вызвано ориентацией флюорофора в 3D пространстве, которое не всегда идеально совмещалось с плоскостью наблюдения и вместо этого изгибалась или наклонялось.
Это явление известно как "эффект дипольной ориентации" и является серьезным ограничивающим фактором в флуоресцентной микроскопии. Эффект связан с низкой точностью измерений в Z-направлении и, как показали исследования, может быть исправлен.
Криогоенные условия помогли решить проблему
Именно здесь в игру вступают измерения в криогенных условиях.
Молекулы мгновенно замораживаются на месте, что позволяет проводить высокоточные 3D измерения, противодействующие эффекту ориентации диполя.
Точность (воспроизводимость), с которой были обнаружены флюорофоры, составляла ±1 нанометр на плоскости наблюдения и ±11 нанометров в Z-направлении, или глубина, что является беспрецедентной для данного типа микроскопии.
Благодаря этим поправкам исследователям удалось обнаружить флюорофоры на молекулах ДНК с нанометровой точностью (совпадение с истинным значением).
Исправив эффект дипольной ориентации, им удалось повысить точность локализации этих флюорофоров до нанометрического уровня.
Ученые все еще работают над этим
Исследовательская группа продолжит работу над этим подходом, используя пару флюорофоров, специально разработанных для криогенных условий, с помощью которых она рассчитывает получить еще лучшие результаты.
Этот вид крио-флуоресцентной микроскопии будет способствовать выявлению механизмов и процессов внутри клеток на молекулярном уровне.
Достижения в области микроскопии, несомненно, помогут нам в нашем стремлении понять жизнь и продвинуться вперед в областях медицины и биоинженерии.
