Аннотация
Lpt - это 29 аминокислотный токсин I типа, идентифицированный в ДНК плазмиды диких штаммов Lactobacillus rhamnosus, выделенных из пищи. Ранее сообщали, что транскрипция гена-кодировщика подвергалась повышенной регуляции в условиях дефицита питательных веществ, имитирующих созревание сыра. Гетерологическая экспрессия пептида Lpt в E. coli привела к ингибированию роста клеток, нуклеоидной конденсации и нарушению целостности клеточной мембраны.
Слияние пептида Lpt с флуоресцентным белком mCherry позволило визуализировать накопление пептида в мембране, а эксперименты по мутагенезу показали, что либо введение отрицательно заряженной аминокислоты в гидрофобную α-спинку, либо удаление гидрофильной области С-конца приводит к образованию нетоксичного пептида. AFM-изображение клеток экспрессии кишечной палочки Lpt выявило наличие поверхностных дефектов, совместимых с потерей части наружного бислойного мембранного слоя. Это наблюдение подтверждает так называемую "ковровую" модель, в соответствии с которой пептид Lpt должен дестабилизировать упаковку фосфолипидов с помощью механизма, подобного механизму сдерживания, приводящего к удалению небольших участков бислоя путем мицелиализации.
Введение
Системы токсин-антитоксин (ТА) состоят из стабильного токсина, белка или пептида, способного выполнять жизненно важную клеточную функцию, и нестабильного антитоксина, белка или некодирующей РНК, способной противодействовать токсинной активности. Системы ТА широко распространены в плазмидах и хромосомах бактерий и археев и классифицируются на шесть различных типов в зависимости от природы и механизма действия их антитоксинов.
Системы ТА типа I характеризуются гидрофобным токсинным пептидом и антитоксином РНК, способным влиять на синтез токсинного пептида, взаимодействуя с его кодирующей мРНК. Тем не менее, в различных системах ТА типа I одного только антитоксина РНК недостаточно для плотной блокировки экспрессии токсина, и перевод токсина мРНК может произойти только после обработки. Для токсинов типа I были предложены различные физиологические функции, такие как поддержание плазмиды, стресс-реакция7 и устойчивость к антибиотикам, наряду с различными механизмами действия. Например, цитоплазматические токсины, такие как SymE и RalR, катализируют расщепление нуклеиновой кислоты, а мембранные токсины, такие как Hok, Fst и LdrD, вызывают образование пор и/или нуклеоидную конденсацию. Hok/sok от E. coli и fst-RNAI/RNAII от E. faecalis относятся к наиболее характерным системам ТП I типа. Hok/sok был первоначально определен как стабилизационный локус плазмиды R112 , но позже исследования обнаружили несколько гомологических систем в хромосомной ДНК грамотрицательных бактерий предполагая, что для этой системы ТА, помимо постсегрегационной гибели, существуют другие функции.
Фазовоконтрастный микроскопический анализ клеток E. coli, экспрессирующих Хоктоксин, выявил необычную морфологию, характеризующуюся плотными структурами, расположенными на полюсах клеток. Недавно было показано, что гомологичный пептид HokB, слитый с флуоресцентным белком mCherry, сохраняет токсичность и ассоциируется с клеточной мембраной. Эксперименты in vitro с использованием синтетических и натуральных липидных бислоев показали способность пептида HokB образовывать поры.
Первоначально система Fst-RNAI/RNAII TA была идентифицирована в плазмиде pAD1 из Enterococcus faecalis, однако позднее исследования обнаружили несколько гомологических систем в хромосоме и плазмидах различных грамположительных бактерий. Флуоресцентные микроскопические исследования, проведенные на энтерококковых фекалиях и субтилисе Bacillus, показали, что экспрессия Fst пептида вызывает нуклеоидную конденсацию, нарушения деления клеток и повреждения мембраны. Аналогичные результаты наблюдались и в трансмиссионных электронных микрографиях Staphylococcus aureus, экспрессирующих токсинный пептид I типа, гомологичный к Fst18. ЯМР-структурное определение показывает, что Fst образует мембраносвязывающую α-спираль в N-концевой области с внутренне неупорядоченным и заряженным C-концевым хвостом, направленным в цитозол.
Недавно в плазмидной ДНК Lactobacillus rhamnosus, нестартерной молочнокислой бактерии типа I TA с генетической архитектурой, аналогичной системе fst-RNAI-RNAII, была обнаружена система, способная адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды, характерным для долгоспелых сыров, что сыграло важную роль в развитии вкуса. Токсин, кодирующий мРНК, был первоначально идентифицирован в транскриптомических экспериментах, направленных на анализ последовательностей, экспрессированных штаммами
L. rhamnosus, выращенными в условиях недостатка питательных веществ. Биоинформационные анализы предполагаемого локуса ТА выявили две конвергентно транскрибированные РНК: РНКИ-кодировка для 29 аминокислотного токсина под названием Lpt и RNAII, который является некодирующей РНК, выступающей в качестве антитоксина. В данной работе сообщаем функциональную характеристику Lpt токсина в гетерологическом штамме E. coli C41(DE3) pLysS с помощью флуоресцентного и атомно-силовой микроскопии. Результаты показывают, что пептид Lpt ингибирует рост кишечной палочки и вызывает нуклеоидное уплотнение с потерей целостности мембраны. Повреждение мембраны непосредственно визуализировалось путем AFM визуализации клеточной поверхности, обеспечивая поддержку дестабилизации фосфолипидного бислоя с помощью механизма действия, подобного механизму сдерживания.
Результаты
Экспрессия Lpt приводит к торможению роста, нуклеоидной конденсации и повреждению мембраны.
В предыдущем исследовании проанализировав токсичность пептида Lpt в E. coli DH10bT1R, преобразованного рекомбинантным вектором pSRKKm-lpt, укрывающим последовательность кодирования Lpt под контролем лактозодобывающего промотора лактозы. Хотя в присутствии лактозы наблюдали ингибирование роста, полностью подавлять промотор даже в присутствии глюкозы не представлялось возможным. Чтобы обойти эту проблему и добиться более строгого контроля экспрессии Lpt, в данном исследовании последовательность кодирования Lpt была клонирована в векторе pET11b (pET11b-Lpt), который затем был использован для преобразования клеток PLysS E. coli C41 (DE3). В отсутствие IPTG кривые роста клеток E. coli, трансформированных либо с пустым pET11b, либо с векторами pET11b-Lpt, очень похожи (Дополнительный рис. S1), что указывает на полное подавление токсичного пептида. Токсичность Lpt проверялась путем мониторинга роста клеток во времени в жидкой среде LB в присутствии индуктора IPTG или при его отсутствии. Как показано на рис. 1А,В, рост клеток кишечной палочки значительно ингибируется после индукции, подтверждая токсическую активность пептида Lpt. Однако через три часа после индукции рост клеток начинается заново, о чем свидетельствуют повышенные значения OD600 и CFU/ml, что наблюдается и в случае других токсинов типа I23 .
Для характеристики морфологии клеток при ингибировании роста использовали флуоресцентную микроскопию и мембранопроницаемый синий флуоресцентный краситель 4',6',диамидино-2-фенилиндол (DAPI), который преимущественно окрашивает нуклоидную ДНК. Для этого анализа, индуцированные клетки были собраны после двух часов индукции и по сравнению с неиндуцированными клетками, выращенными за то же время. На рисунке 1С показаны неиндуцированные клетки с удлиненным нуклоидом, занимающие весь клеточный объем. И наоборот, при индуцированных клетках флуоресцентный сигнал DAPI обнаруживает круговой и более компактный нуклероид, расположенный в середине клетки (рис. 1D). Для количественного анализа наблюдаемого уплотнения нуклероидов измерялась площадь запятнанного синим цветом нуклероида (см. Методы). Как показано на рис. 1Е, при индукции IPTG среднее распределение площади нуклоидов изменяется от 478 ± 203 пикселей до 153 ± 109 пикселей. Этот результат подтверждает, что бактериальный нуклоид подвергается конденсации из-за экспрессии Lpt.
Оставайтесь с каналом Наука 1.0 дальше, больше.
