Аннотация
Разработка и утверждение разработанных методов клеточной терапии являются революционными подходами к лечению заболеваний. Однако эти жизненно важные методы лечения требуют широкого использования неэффективного биотехнологического оборудования и специализированных реагентов, которые могут привести к удорожанию лечения. Интеграция новых генетических материалов в клетки-мишени, таких как вирусная трансдукция, является одним из самых дорогостоящих и трудоемких этапов в производстве клеточной терапии. Разработаны подходы к снижению затрат, связанных с доставкой генов, с использованием микрожидкостных устройств для повышения общей эффективности. Однако эти микрофлюидные подходы требуют либо большого количества вируса, либо предварительной концентрации клеток с высоколитерными вирусными частицами.
Здесь мы описываем разработку устройства микрожидкостной трансдукции (MTD), которое сочетает в себе микрожидкое пространственное ограничение с адвективным потоком через мембрану для эффективной колокализации клеток-мишеней и вирусных частиц. Мы демонстрируем, что MTD может повысить эффективность челюстно-лицевой трансдукции как для Т-клеточных, так и для гемопоэтических мишеней (ГСК) более чем в два раза по сравнению со статическим контролем. Кроме того, в MTD насыщенность трансдукцией достигается за счет того, что для достижения насыщения в статических условиях требуется лишь половина вируса. Более того, мы показали, что MTD трансдукция не оказывает негативного влияния на жизнеспособность клеток и потенциал расширения.
Введение
Разработка и утверждение разработанных методов клеточной терапии произвела революцию в лечении целого ряда заболеваний, которые трудно или невозможно лечить с помощью традиционной терапии. Химерные антигеновые рецепторы Т-клеточной терапии (CAR-T) являются мощными новыми методами лечения злокачественных новообразований, а гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) сконструированы для длительного лечения редких заболеваний крови, таких как серповидноклеточная анемия, церебральная адренолейкодистрофия (КАЛД) и бетаталассем. К сожалению, основной проблемой при проведении этих обработок является высокая стоимость, связанная со сложной производственной цепочкой, квалифицированной рабочей силой и специализированными реагентами, необходимыми для производства. Эти ограничения усугубляются тем, что используемое в настоящее время оборудование не предназначено специально для производства клеточной терапии. Следовательно, однократное лечение CAR-T может стоить пациенту сотни тысяч долларов, значительно ограничивая доступность и широкое использование этих методов лечения. Без значительного прогресса в биотехнологии, расширение масштабов производства этих препаратов будет препятствовать широкомасштабному развитию инженерной клеточной терапии, ограничивая ее применение конкретными или экстремальными случаями.
Клинически доступной клеточной терапии являются аутологичные продукты, которые требуют выделения целевой популяции клеток у пациента и генетической манипуляции с этими клетками-мишенями либо для устранения конкретных генетических дефектов, либо для того, чтобы клетка-мишень могла распознавать и атаковать больные клетки в теле1,2. В настоящее время интеграция нового генетического материала в клетки-мишени является одним из наиболее затратных и трудоемких этапов в производстве инжиниринговой клеточной терапии. Хотя в настоящее время изучаются как вирусные, так и невирусные методы доставки генов, такие как сонопорация и электропорация наиболее распространенным методом введения новых генетических материалов в клетки-мишени является использование трансдукции ex vivo вирусов. Обычно вирус, содержащий упакованный генетический материал, вводится в культурную среду ex vivo с клетками-мишенями в условиях статической культуры, где гравитация и диффузия являются посредниками колокализации вируса и клеточных частиц. Эффективность связывания вирусных частиц может быть смоделирована с использованием бимолекулярной кинетики первого порядка, важным фактором которой является концентрация вируса. Центрифугирование культур-мишеней клеток-вирусов продемонстрировало повышение эффективности трансдукции, хотя точный механизм повышения трансдукции остается неясным. Хотя были продемонстрированы доказательства ограниченного осаждения более крупных частиц вируса ВИЧ с помощью спиновых протоколов, типичные скорости центрифугирования намного ниже рассчитанных для эффективного осаждения вируса, особенно более мелких вирусных частиц, таких как адено-ассоциированный вирус (AAV)16,17. К другим объяснениям трансдукции с помощью центрифугирования относятся вызванные стрессом изменения в цитоскелетных структурах, которые способствуют связыванию вирусов, что также предполагает, что эффективность протоколов центрифугирования будет зависеть от реакции на стресс клеток и индукции соответствующей рецепторной экспрессии.
В качестве альтернативы были разработаны небольшие молекулы и пептидные добавки, связывающие как вирусные клетки, так и клетки-мишени и стимулирующие взаимодействие между двумя частицами19,20. Например, колокализация клеток-мишеней и ретровирусов на специфических фрагментах фибронектина увеличивает генетическую трансдукцию клеток млекопитающих в 2-6 раз21,22. Хотя эти добавки доказали свою эффективность в качестве средства повышения эффективности трансдукции, большинство из них являются дорогостоящими, запатентованными и должны быть исключены из конечного терапевтического продукта посредством дорогостоящих и/или трудоемких этапов мойки и проверки.
Использование же микрофлюидов, напротив, может эффективно стимулировать колокализацию вируса и клеток-мишеней без риска повреждения клеток и необходимости обширной промывки. Чак и Палссон продемонстрировали высокие темпы вирусной трансдукции (общий процент трансдуцированных клеток), достигнутые в относительно короткие периоды совпадения, когда нагруженная вирусом среда проходила мимо клеток-мишеней, захваченных клеточной непроницаемой мембраной. Хотя эти методы дали высокую скорость трансдукции, значительная часть вируса проходит мимо клеток-мишеней и проходит через мембрану без взаимодействия, и поэтому эффективность использования переносчиков (описывается как отношение количества клеток, трансдуцированных к количеству используемых вирусных частиц) является низкой, снижая полезность этого метода для производства в клинических масштабах. В качестве альтернативы для колокализации клеток-мишеней и концентрированного вируса в микролитрах были использованы микрожидкие каналы, что привело к увеличению эффективности трансдукции более чем в 4 раза по сравнению со статическим контролем.
Дальше только интереснее, оставайтесь с каналом Наука 3.0
