ImageJ - это весьма удобная для исследователей программа обработки изображений, разработанная Национальным институтом здравоохранения и Лабораторией оптических и вычислительных приборов (LOCI, Висконсинский университет). В свою очередь, Fiji (акроним: Fiji Is Just ImageJ) является пакетом обработки изображений с открытым исходным кодом, основанный на ImageJ.
Поскольку Fiji - это проект с открытым исходным кодом, то каждый пользователь может внести свой вклад с помощью плагинов, исправлений, отчетов об ошибках, учебных пособий, документации и иллюстраций в усовершенствование этого инструмента.
В этой статье будут изложены наиболее часто используемые приемы для решения задач с помощью Fiji.
Основная версия Fiji уже содержит некоторые плагины для работы, тем не менее, если необходимо, пользователь может скачать новые плагины из архива.
В частности, для открытия файлов изображений, полученных с помощью микроскопов Olympus, можно использовать плагин OlympusImageJPlugin для загрузки файлов форматов vsi / oir / omp2info и отображения некоторых метаданных. Использование плагина выполняется с панели инструментов по простой схеме Plugins/OlympusViewer/Viewer.
После выбора нужного файла открывается окно, к примеру, с изображением или результатами сканирования образца по оси Z с помощью конфокальной микроскопии.
В данном случае мы имеем в качестве исходных данных результаты конфокального сканирования клеток в двух каналах: люминесценция красителя (красный канал) и дифференциально-интерференционный контраст (переключение между каналами осуществляется верхним бегунком, а нижним - выбор слоя сканирования):
Одним из наиболее удобных вариантов отображения сканирования образцов является ортогональная проекция. Ортогональную проекцию можно воссоздать за счет команд: Image/Stacks/Orthogonal Views:
В результате мы получим следующее изображение клеток с отображением сканирования по оси Z, где с помощью перекрестия можно выбрать интересующие нас сечения:
Каждое изображение и ортогональные проекции можно сохранять по отдельности.
Для удобства на изображение можно вывести масштабные отрезки, используя команду Analyze/Tools/Scale bar…
В открывшемся окне можно выбрать ширину масштабного отрезка в микрометрах и его высоту в пикселях, его положение и детали подписи. Важно отметить, что если вы имеете дело не с исходным изображением (без данных кратности увеличения), то ширину масштабного отрезка можно будет выбрать только в пикселях.
В результате получаем масштабный отрезок в нужном месте и необходимой ширины.
Многие задачи так или иначе связаны с анализом сигнала люминесценции образцов.
Для сбора сигнала люминесценции со всего образца часто проводят наложение всех слоев сканирования по оси Z в одно изображение.
Для наложения слоев используется команда Image/Stacks/Z Project. В открывшемся окне мы выбираем начальный и конечный слайд для получения итогового изображения с наложением слоев.
В итоге у нас накладываются слои по оси Z (для канала красителя и дифференциально-контрастного канала):
При желании, мы можем разделить каналы, чтобы работать с ними по отдельности (Image/Color/Split Channels):
Получаем отдельные наложения по оси Z канала люминесценции красителя и канала дифференциально-интерференционного контраста.
Предположим теперь, что нас интересует сигнал люминесценции в пределах некоторых клеток. Для начала наметим контуры интересующих нас клеток с помощью инструмента Freehand selections:
С помощью этого инструмента на канале дифференциально-интерференционного контраста выделяем первую клетку:
Добавим выделенный контур в область интереса (ROI, Region of interest) командой Image/Overlay/Add Selection, а затем откроем список выделенных контуров Image/Overlay/To ROI Manager:
Выделяем следующий контур клетки и добавляем его к списку с помощью ROI Manager (Add):
Аналогичным образом добавляем и другие контуры клеток
Возвращаясь к окну с каналом люминесценции красителя, переводим его в 8-битный формат:
Стоит отметить, что что иногда 8-битные изображения получаются лучше, если сохраненный файл канала люминесценции вновь разбить на псевдоканалы (Image/Color/Split Channels).
Прежде чем начать анализировать сигнал, зададим диапазон интенсивности люминесценции, который нас интересует, с помощью команды Image/Adjust/Threshold…
В окне диапазона выбираем сбор сигнала интенсивности люминесценции, например от 25 до 255 относительных единиц.
В результате, с канала люминесценции красителя будут выделены только те пиксели, которые люминесцируют с интенсивностью от 25 до 255 относительных единиц. Все кластеры с красителем, которые люминесцируют с интенсивностью менее 25 относительных единиц, выделены не будут.
Воспользуемся контурами клеток, которые мы выделяли с канала дифференциально-интерференционного контраста (Image/Overlay/From ROI Manager):
В результате мы так переносим контуры клеток на интересующий нас канал люминесценции клеток.
Далее с данных контуров мы можем провести вычисления. Для начала выбираем параметры, которые хотим вычислить с помощью команды Analyze/Set Measurements…
В полученном окне выбираем интересующие нас параметры
После выбора параметров высчитываем данные в открытом ROI Manager командой Measure:
В итоге мы получаем таблицу с данными для каждого контура клеток:
