5 подписчиков
Вы пробовали выделять ДНК из клеток? Попробуйте!
...
Выделение ДНК из клеток — многоэтапный процесс, включающий:
1) лизис клеток,
2) отделение ДНК от других компонентов,
3) очистку.
Основные этапы выделения ДНК
1. Лизис клеток — разрушение клеточных мембран и высвобождение ДНК.
Для этого используются:
1) химические (детергенты, хаотропные агенты, ферменты),
2) физические (механическое разрушение, ультразвук, давление),
3) комбинированные методы.
2. Отделение ДНК от других клеточных компонентов — белков, липидов, полисахаридов и т. д.
Для этого применяются:
1) химические методы (например, экстракция растворителями),
2) сорбционные технологии,
3) магнитные частицы и др. подходы.
3. Очистка ДНК — удаление ингибиторов, денатурация белков, концентрирование (при необходимости).
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
1. Фенол-хлороформная экстракция. Клеточный лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. Фенол денатурирует белки, хлороформ растворяет жиры, изоамиловый спирт уменьшает пенообразование. После центрифугирования образуются две фазы: в органической (нижней) фазе находятся липиды и жиры, на границе фаз — белки, а нуклеиновые кислоты остаются в водной (верхней) фазе.
2. Использование силикатных сорбентов. После лизиса клеток с помощью хаотропного агента (гуанидина тиоционата) ДНК сорбируется на носителе (частицах силики). После отмывок ДНК отделяется с помощью элюирующего буфера.
3. Сорбция на спин-колонках. Технология, при которой клеточный лизат наносят на колонку с силикатной матрицей. ДНК остаётся на колонке, а примеси проходят через неё. После промывки ДНК элюируют в пробирку.
4. Магнитные частицы. К клеточному лизату добавляют магнитные частицы, на поверхности которых адсорбируются нуклеиновые кислоты. После отмывки и инкубирования ДНК отделяется от магнитных частиц и переносится в другую пробирку.
ДРУГИЕ МЕТОДЫ
1. Осаждение этанолом или изопропанолом. ДНК осаждают из раствора, а полученный осадок растворяют в буферном растворе.
2. Высаливание с использованием высоких концентраций солей. Например, добавление 6 М NaCl к лизату клеток после обработки смесью SDS с протеиназой К с последующим центрифугированием для разделения осадка белка и водного раствора ДНК в супернатанте.
3. Ферментативное термозависимое выделение. Удаление белков из клеток с разрушенными стенками происходит с помощью термофильной протеиназы ЕА1. Метод поддаётся автоматизации, отличается быстротой и пригоден для выделения ДНК из минимального количества биоматериала.
При выборе метода учитывают тип клеток, требуемую степень чистоты и концентрации ДНК, источник образца (тип ткани, организма), метод детектирования и его аналитическую чувствительность, объём образца и время на проведение процедуры. Современные лабораторные технологии включают автоматизированные системы, которые позволяют ускорить процесс выделения нуклеиновых кислот и повысить точность анализа.
Для выделения ДНК могут потребоваться следующие оборудование, приборы и посуда:
1. Термоциклеры (амплификаторы). Приборы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет увеличить количество ДНК-образцов для последующего анализа.
2. Центрифуги. Устройства для отделения частиц от жидкости путём вращения. Используются для выделения ДНК из образцов (крови, тканей).
3. Микроцентрифужные пробирки. Для хранения и транспортировки образцов ДНК.
4. Микропипетки и дозаторы. Инструменты для точного измерения и переноса небольших объёмов жидкостей, включая растворы для ПЦР и образцы ДНК.
5. Водяные бани. Устройства для поддержания постоянной температуры растворов во время реакций, таких как ПЦР.
6. Гель-электрофорезные системы. Оборудование для разделения фрагментов ДНК по размеру и заряду в геле под действием электрического поля.
7. Источники ультрафиолетового излучения. Используются для визуализации результатов электрофореза, когда ДНК окрашивается специальным красителем, который флюоресцирует под УФ-лучами.
8. Анализаторы ДНК. Приборы для автоматического определения размеров фрагментов ДНК после электрофореза.
9. Персональные компьютеры. Применяются для обработки и анализа данных.
3 минуты
2 дня назад