126 подписчиков
Орексины — это нейромедиаторы пептидной природы, которые синтезируются исключительно в клетках латеральной зоны гипоталамуса
Их секреция связана с регуляцией эмоционального возбуждения человека, системой вознаграждения и принятием решений
Исследователи из Института фармакологии и токсикологии Цюриха создали генетически кодируемый сенсор, который позволил проследить динамику взаимодействия орексина с рецептором in vivo
Для создания сенсора ученые применили широко известный метод мутагенеза зеленого флуоресцентного белка GFP
В результате генетических манипуляций прежние N- и C-концы белка лигируются, а новые образуются в другом месте
При этом вторичная структура белка не нарушается
Такой подход позволяет получить более подвижный флуоресцентный белок cpGFP, реагирующий на конформационные изменения. Соединив cpGFP с рецептором орексина, исследователи получили сенсор OxLight1, флуоресцирующий при активации нейромедиатором
В качестве отрицательного контроля они использовали конструкцию с мутациями в сайте связывания, которая не флуоресцировала в присутствии орексина
В культуре нейронов сенсор демонстрировал исключительную специфичность к орексину и детектировал его концентрацию в пределах физиологической нормы
Флуоресценция OxLight1 была стабильна в течение 1.5 часа после активации и могла быть выключена с помощью антагонистов орексина
Более того, связывание нейромедиатора не приводило к активации нижележащих сигнальных путей и вмешательству в метаболизм клетки
Подтвердив работу своего сенсора in vivo на мышах, исследователи проследили его динамику во время физической активности и циклов засыпания-пробуждения
Для наблюдений в мозг мыши вживляли оптоволокно
Уровень флуоресценции OxLight1 возрастал в течение 500 мс после начала бега, а максимальная амплитуда коррелирует со скоростью движения мыши
(В этом эксперименте животные с зафиксированной головой бежали по вращающемуся кругу)
Сенсор также флуоресцировал при поднятии мыши за хвост, что говорило о секреции орексина при аверсивных (неприятных для животного) стимулах
Изучив данные электроэнцефалографии и электромиографии параллельно с использованием OxLight1, исследователи проанализировали активность орексиновых нейронов во время сна и бодрствования
Активное высвобождение орексина наблюдали, когда животное бодрствовало, а также во время фазы медленного сна
Введение снотворного препарата суворексанта, действующего на орексиновые рецепторы, приводило к понижению сигнала от OxLight1
Кроме того исследователи подтвердили, что разные типы анестетиков имеют различные механизмы действия — изофлуран, в отличие от медетомидина, действовал как антагонист орексина и приводил к снижению сигнала OxLight1
По данным ученых, их сенсор может использоваться в двухфотонной флуоресцентной микроскопии
В числе ее преимуществ — более точный фокус и возможность использования инфракрасного излучения, которое лучше проникает через биологические ткани
С помощью данного метода авторы изучили динамику орексина в коре головного мозга при пробуждении от наркоза
Через минуту после прекращения подачи изофлурана флуоресценция сенсора в зрительной коре начала возрастать и достигла плато через 4 минуты
При более детальном анализе обнаружилось, что в зрительной коре существуют стабильные области с низкой и высокой активностью OxLight1
Статистический анализ выявил корреляцию между высокоактивными областями на стадии нарастании флуоресцентного сигнала
Duffet, L. et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. // Nature Methods 19, 231–241 (2022). DOI: 10.1038/s41592-021-01390-2
2 минуты
15 февраля 2024