Корреспондент Гу Бон Хёк
![[Getty Image Bank]](https://avatars.dzeninfra.ru/get-zen_doc/271828/pub_6a33ab1a580ee477092a8198_6a33ac3859c7583a34c177b4/scale_1200)
Группа корейских исследователей разработала плазмонную платформу для жидкостной биопсии, способную со сверхвысокой чувствительностью обнаруживать онкогены в крови и моче пациентов с ранними стадиями рака толстой кишки (0-я и 1-я стадии).
Эта технология позволяет обнаруживать крайне малые количества онкогенов на ранних стадиях рака, снижая при этом нагрузку, связанную с традиционной биопсией, и поэтому привлекает внимание как технология прецизионной диагностики нового поколения, способная ускорить раннюю диагностику рака и мониторинг рецидивов.
Исследовательская группа под руководством докторов Ли Мин Ён и Пак Сон Гю из Отдела исследований био- и медицинских материалов Корейского института материаловедения (KIMS) проанализировала образцы опухолевой ткани, крови и мочи пациентов с ранними стадиями рака толстой кишки и подтвердила высокую степень совпадения результатов между образцами (более 90%), доказав тем самым возможность клинического применения данной технологии в качестве метода неинвазивной прецизионной диагностики рака.
Ранее исследовательская группа разработала технологию плазмонной жидкостной биопсии, позволяющую со сверхвысокой чувствительностью, соответствующей мировым стандартам, обнаруживать мутации гена EGFR в крови пациентов с раком лёгких. Настоящий результат является продолжением предыдущих исследований, в ходе которого область применения данной платформы расширилось до анализа KRAS — одного из основных онкогенов рака толстой кишки, — что имеет большое значение, поскольку онкогены были обнаружены не только в крови, но и в моче.
С расширением применения прецизионной диагностики рака и персонализированного лечения растет интерес к технологиям жидкостной биопсии, позволяющим анализировать онкогены исключительно по крови или моче. Жидкостная биопсия позволяет с помощью лишь нескольких капель крови прогнозировать возможное наличие в организме шести основных видов рака, что способствует раннему выявлению и лечению. По сравнению с традиционной биопсией, требующей непосредственное взятие фрагментов раковой опухоли, эта технология значительно сокращает затраты и время.
Однако поскольку в крови и моче пациентов с раком на ранней стадии онкогены присутствуют в крайне малых количествах, традиционные технологии на основе ПЦР или сверхглубокого NGS (секвенирования нового поколения) имели ограничения с точки зрения чувствительности обнаружения, стоимости и времени анализа.
Иллюстрация принципа работы «плазмонной платформы для жидкостной биопсии». В случае нормального гена амплификация и генерация сигнала подавляются, а при наличии мутации KRAS сигнал усиливается и обнаруживается платформой. Аннотация: Точное выявление кодоновых мутаций в гене KRAS имеет решающее значение для прецизионной онкологии при колоректальном раке (КРР), однако традиционные методы жидкостной биопсии зачастую не обладают достаточной чувствительностью для обнаружения редких вариантов циркулирующей ДНК (ctDNA), особенно на ранних стадиях заболевания. Мы разработали трехмерный (3D) плазмонный микромассив для анализа гена KRAS, сочетающий амплификацию с помощью блокирующей рекомбиназной полимеразы и плазмон-усиленную флуоресценцию. Блокирующие зонды, модифицированные квенчером (гасителем), подавляют ДНК дикого типа, одновременно обеспечивая избирательную амплификацию сигнала мутантов. Использование одного набора праймеров и зондов на каждый кодон позволяет всесторонне выявлять все замены в кодонах 12/13, 61 и 146 гена KRAS. Платформа обеспечила обнаружение с чувствительностью до 1 фМ путем прямой гибридизации и до 100 зМ после амплификации с блокировкой, что превосходит чувствительность традиционной ПЦР и секвенирования нового поколения. Специфичность на уровне кодонов была подтверждена на клеточных линиях КРР, где для каждой мутации наблюдались четкие сигналы. Клинический анализ 58 пациентов показал 100%-ное совпадение результатов анализа тканей, плазмы и мочи в случаях злокачественных новообразований с положительным результатом на мутацию при наличии достаточного количества исходного материала, что свидетельствует о точном отражении профилей опухолей. В случае доброкачественных опухолей обнаружение было редким, несмотря на наличие мутаций в тканях, что, вероятно, связано с ограниченным высвобождением циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA). Данный плазмонный микромассив обеспечивает сверхчувствительное, специфическое и неинвазивное обнаружение, способствуя ранней диагностике, мониторингу минимального остаточного заболевания и сквозному ведению пациентов с КРР [Предоставлено Корейским институтом материаловедения]
Рисунок S1. Характеристика трехмерного наноплазмонного субстрата с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
Рисунок S2. Фотография чипа с трехмерным наноплазмонным микромассивом для мультиплексного обнаружения мутаций гена KRAS.
Рисунок S3. Оптимизация времени гибридизации микромассива и концентрации блокатора дикого типа. (a) Флуоресцентные изображения, полученные после поверхностной гибридизации при различных временах инкубации (10, 20, 30 и 40 мин) с использованием матрицы концентрацией 100 нМ. (b) Оценка концентрации зонда-гасителя блокера дикого типа (5, 10 и 15 мкМ) в условиях присутствия матрицы дикого типа концентрацией 100 нМ. (c) Флуоресцентная детекция мутантного матричного ДНК до концентрации 1 фМ в присутствии 10 мкМ блокера дикого типа.
Рисунок S4. Оценка линейности наноплазмонного флуоресцентного анализа. Интенсивность флуоресценции измерялась после гибридизации на наноплазмонном субстрате с использованием девяти концентрационных точек мутантного матричного ДНК KRAS в диапазоне от 100 аМ до 1 пМ.
Рисунок S5. Оценка подавления амплификации дикого типа ингибитором, меченным кванчером. (a) Кривые амплификации в режиме реального времени для мутантных и диких шаблонов в присутствии 10 мкМ ингибитора дикого типа. (b) Значения Ct, построенные в зависимости от логарифма концентрации шаблона. (c) Сравнительные значения Ct для мутантных и диких шаблонов в условиях ингибирования.
Рисунок S6. Воспроизводимость полностью блокированного анализа с использованием микроматрицы RPA–плазмонной при концентрации 500 зМ (15 копий) в условиях избыточного фона дикого типа (10 нМ ДНК дикого типа).
Рисунок S7. Эффективность детекции после экстракции cfDNA из биологических матриц.Эффективность анализа в (a) сыворотке плода крупного рогатого скота (FBS) и (b) моче здорового человека, обогащённой 100-мерными матрицами мутантной одноцепочечной ДНК (100 фМ–100 зМ) после экстракции cfDNA.
Рисунок S8. Стабильность при хранении плазмонных микроматриц, функционализированных стрептавидином и биотином, после одной недели сухого хранения при 4 °C. После гибридизации были получены типичные флуоресцентные изображения и количественные данные по интенсивности флуоресценции (а.е.).
Рисунок S9. Анализ размера фрагментов cfDNA, подтверждающий минимальное загрязнение геномной ДНК. Электрофорез в агарозном геле cfDNA, экстрагированной из образцов колоректального рака, показал ожидаемое распределение размеров фрагментов cfDNA (~150–200 п.н.), при этом также наблюдались полосы/смазы высокомолекулярной геномной ДНК (gDNA), указывающие на загрязнение gDNA.
Исследовательская группа разработала платформу для жидкостной биопсии, способную с высокой чувствительностью обнаруживать крайне малые количества мутаций гена KRAS, объединив технологию плазмонного усиления сигнала и технологию селективного амплификации генов. Особенностью разработки является использование плазмонного микромассива на основе металлических наноструктур, который значительно усиливает слабые световые сигналы и позволяет избирательно выделять и обнаруживать крайне малые количества мутировавших генов, смешанных с нормальными генами. Ожидается, что благодаря расширению спектра анализируемых образцов — не только крови, но и неинвазивных образцов, таких как моча — удастся снизить нагрузку на пациентов, а также широко применять эту технологию в таких областях, как ранний диагноз рака, требующий повторных обследований, сопутствующая диагностика, оценка реакции на лечение, мониторинг минимального остаточного заболевания (MRD) и выявление рецидивов.
«Данное исследование подтвердило возможность применения плазмонной платформы для жидкостной биопсии при раке толстой кишки, а также возможность анализа онкогенов на основе анализа мочи» - отметила старший научный сотрудник Ли Мин Ён, добавив: «В будущем мы планируем развить эту платформу в систему точной диагностики, применимую к различным видам рака, и использовать её для ранней диагностики болезни и мониторинга рецидивов».
Результаты данного исследования опубликованы в международном научном журнале «NPJ Precision Oncology».
nbgkoo@heraldcorp.com
#южнаякорея #корея #политика #экономика #промышленность #технология #биотехнология #биопсия #генетика #медицина #диагностика #онкология #рактолстойкшки #болезни #бизнес #финансы #общество #культура #искусство #азия