Специалист «Диаэм» Анастасия Жирякова рассказала о технологии оптической томографии для визуализации биолюминесценции и флуоресценции in vivo, in vitro, ex vivo, ее аппаратном обеспечении от компании Vilber (Франция) и о примерах экспериментов, уже осуществленных с использованием этой технологии в области исследования процессов in vivo (онкогенез, миграция клеток, исследование динамика воспалительных и инфекционных процессов). Анастасия затронула темы перспектив применения Newton в доклинических исследованиях для оценки эффективности фармпрепаратов на мышах, возможностей программного обеспечения (атласа органов и костей, количественной оценки сигнала in vivo в динамике).
История развития метода
Компания Vilber – французский производитель, с 1954 года работающий только в направлении УФ инструментов.
Первые научные публикации, посвященные документированию мелких животных, были сделаны в 2011 г. на стандартных гель- и хемидокументирующих системах. Это натолкнуло производителя на мысль о необходимости более подходящей системы для выполнения таких задач. Так в 2016 г. появилась система Newton 7.0 mini, которая подключала систему анестезии: живая мышь спала в системе, а в это время можно было без проблем детектировать биолюминесценцию и флуоресценцию in vivo.
В 2019 г. появилась система Newton 7.0 FT Series, ставшая предметом этого вебинара – в ней реализована технология 3D оптической томографии.
Современная система визуализации позволяет документировать in vivo, in vitro, ex vivo биолюминесценцию, флуоресценцию с возможностью получить 3D-топографическое изображение исследуемого животного.
Среди доклинических методов визуализации, применяемых сегодня в исследованиях, можно упомянуть следующие:
- рентгеновская микрография,
- МРТ,
- оптическое изображение,
- позитронно-эмиссионная томография, - КТ,
- УЗИ.
При рассмотрении системы Newton 7.0 FT Series речь пойдет об оптическом изображении.
Преимущества и сфера применения системы Newton 7.0 FT
Преимущества этого инструмента:
- удобство в использовании,
- нет никакой радиации: такую систему можно устанавливать в любой лаборатории без ограничений,
- возможность производить неинвазивные лонгитюдные исследования,
- прибор имеет большую пропускную способность: стандартный Newton 7.0 FT Series рассчитан на пять мышей.
Задачи, которые можно решить с использованием рассматриваемой системы:
- мониторинг опухолей и инфекций, - отслеживание миграции клеток,
- таргетирование молекул наночастицами,
- визуализации сосудистой системы и микроциркуляции.
Объектами исследования могут выступать:
- мелкие животные, чаще всего мыши, а также другие грызуны небольшого размера (крысы, морские свинки, маленькие кролики),
- рыбы,
- срезы органов и тканей ex vivo,
Примеры использования системы для визуализации биолюминесценции с использованием люциферазы
Области применения данного метода – онкология, иммунология, наномедицина, вирусология, нейробиология.
Например, в онкологии этот очень простой метод позволяет проводить мониторинг на протяжении всего заболевания. Он делает возможными неинвазивные исследования, в которых можно локализовать сигнал, получить количественную оценку, и при этом подопытное исследуемое животное остается живым.
Исследование противоопухолевой активности препаратов
Работа, представленная одним из научно-исследовательских институтов Японии, была связана с определением in vivo противоопухолевой активности локорегиональной терапии α-излучением (астат-211) с трастузумабом против перитонеального метастазирования (PM) рецептора эпидермального фактора роста человека 2-позитивного рака желудка (GC) у мышей.
Для этого использовали мышей с упомянутым 2-позитивным раком желудка.
Самкам мышей пятинедельного возраста за неделю до эксперимента вводили внутривенно трансфицированные люциферазой клетки N87/Luc. Через 10 минут после инъекции люциферина в течение 10 с фиксировалась биолюминесценция.
Далее биолюминесценцию у этих мышей PMGC последовательно регистрировали в течение одной недели, и на следующем рисунке можно ознакомиться с результатами.
Контрольной группе мышей вводили только PBS (фосфатно-солевой буфер).
Второй группе вводили трастузумаб в PBS без иных добавок (немаркированный), и результатов практически не отмечено.
Третьей группе вводили только астат-211 (в концентрации 1 мегабеккерель).
Следующим двум группам вводили трастузумаб в сочетании с облучением (астат-211) в различной концентрации – 0.1 МБк и 1 МБк.
Исследователи пришли к следующим выводам, сравнивая рост опухоли у мышей PMGC, которым вводили PBS, немаркированный трастузумаб, свободный астат-211 смесь трастузумаба в астатом-211 в концентрации 0.1 МБк: все упомянутые комбинации либо не дали результата, либо практически не привели к изменениям. А в последней группе (нижняя серия снимков), соответствующей сочетанию трастузумаба с астатом-211 в концентрации 1 МБк, видно, что через три недели сигнал уже не обнаруживался, через пять недель снижалась опухолевая нагрузка, а через семь недель опухоли уже не было видно.
Так было сделано заключение, что сочетание астата-211 с трастузумабом специфично влияет на HER2-положительные GC клетки in vivo и таким образом ингибирует рост опухоли, улучшая выживаемость у мышей PMGC.
Изучение колонизации бактерий
Следующий пример представлен исследовательской лабораторией из Мексики.
Агентом в нем также была люцифераза, а исследователи снимали биолюминесценцию и изучали колонизацию e. coli у мышей: оценивали динамику колонизации энтеротоксигенной кишечной палочки путем проведения биолюминесцентного трекинга.
Для этого создали вектор pRMkluc с люциферазой. Стрептомицин-обработанным четырехнедельным BALB мышам внутрь брюшины инокулировали кишечную палочку К-12 в pRMkluc или К-12 в pBR322.
Через 1 час после заражения снимали биолюминесцентный сигнал.
Эта работа позволяла отследить бактерии и их прохождение через кишечник.
E. coli на рисунке Б, не меченная люциферазой, не проявляла биолюминесцентного сигнала, тогда как e. coli, на которой был вектор с меткой, регистрируется биолюминесцентный сигнал в зоне инокуляции мыши.
Далее исследователи наблюдали прохождение бактерий – кишечных патогенов – через кишечник, чтобы определить колонизацию в динамике.
Брали два вида микроорганизмов – ETEC FMU073332 и e. coli К-12, вводили их стрептомицин-обработанным BALB/c мышам вместе с люциферином. Биолюминесцентный сигнал снимали в момент, когда проводили колонизацию исследуемыми бактериями, а затем через 48 и 120 часов.
При этом наблюдали определенные сигналы биолюминесценции и разное распределение в кишечнике той или иной бактерии. Бактериальные биолюминесцентные сигналы в кишечнике остались у мыши А, а у мыши Б биолюминесцентные сигналы локализовались уже в слепой кишке.
Затем мыши были умерщвлены, их кишечный тракт выделен полностью, начиная с пищевода. Снятие биолюминесцентного сигнала позволило сделать вывод о том, что с помощью биолюминесценции можно иметь представление о времени и пространстве локализации кишечной палочки, о ее метаболической активности, и что биолюминесцентные сигналы, испускаемые, например, на верхнем рисунке нашей бактерией, расположены именно в проксимальном отделе в подвздошной кишке.
Так можно визуализировать взаимодействие хозяина и патогена у живых животных.
Визуализация единичных клеток
Следующий пример представлен научно-исследовательской лабораторией из Канады.
Эта работа была посвящена визуализации каждой клетки и подбору условий наблюдения, для чего снимали экспозицию через 30 минут и через 2 минуты.
Здесь использовали клетки линии рака молочной железы MDA MB, разработанной для экспрессии люциферазы светлячка. Разбавляли в концентрации примерно в 1 клетку на лунку в 96-луночном планшете в 100 мкл DMEM среды.
Показано, что через 30 минут экспозиции при бининге 12х12 и апертуре объектива f/0.70 биолюминесцентное излучение сигнала увеличивается, но дает при этом очень насыщенный сигнал.
А при экспозиции 2 минуты с бинингом 12х12 и широко открытой линзой сигнал улавливается идеально.
Использование флуоресценции в исследованиях и мультиспектральные возможности метода
При переходе к рассмотрению возможностей регистрации флуоресцентного сигнала следует обратить внимание, что наилучшим проникновением в ткани обладает ИК свет. В частности, обнаружено, что длины волн от 650 до 900 нм более эффективно проходят через ткани, чем те, которые находятся в спектре видимого света ввиду высокой автофлуоресценции при видимом свете.
Соответственно, ИК свет лучше использовать, чтобы понимать глубину проникновения, для исследований и формирования 3D-изображения.
Следующий пример предоставлен компанией Nanobiotix (Франция), работающей в сфере наномедицины. Эта компания сейчас предлагает подход к изменению биораспределения лекарства в организме, основываясь на том, что любое вещество при попадании в наш организм после клиренса в первую очередь занимает клетки печени и лишь малая часть попадает в организм. При этом исследователи выдвинули идею о том, что если предварительно занять клетки печени, то изучаемое лекарство будет распределяться лучше и дойдет до зоны интереса.
Для такого переопределения биодоступности в наномедицине был создан липосомальный нанополимер со специфическими физико-химическими свойствами. Этот нанополимер в виде раствора вводили в хвостовую вену мышей и затем снимали флуоресценцию в течение 1 часа с использованием системы Newton 7.0. Установлено, что в течение 10 минут после инъекции большая часть продукта накапливается в печени и только незначительная часть его остается в крови.
На следующем этапе эксперимента взяли две линейки мышей. Одним также вкалывали в хвостовую вену только флуоресцентные наночастицы, другим –сначала нанополимер, а через 10 минут – наночастицы. При этом наблюдали за биораспределением вещества.
В данном случае можно сделать вывод: изображение, полученное с помощью Newton 7.0, демонстрирует, что во втором случае способность нанопраймера увеличивает циркуляцию в крови наночастиц и влияет на характер их распределения, тогда как на верхних рисунках весь флуоресцентный агент все так же концентрируется в печени.
В следующем примере изучали механизм переноса нагруженного доксорубицином наногеля на основе хитозана через кишечный эпителий.
Использовали препарат Cy3-CS, FITC-CMCS и DOX:CS/CMCS-NGs.
Использовали препарат Cy3-CS, FITC-CMCS и DOX:CS/CMCS-NGs. Исследование проводилось с целью понять механизм, связанный с транспортировкой этого комплекса через кишечный барьер. Внимание сосредоточили на клеточно-молекулярном механизме.
Препарат был введен крысам перорально для изучения влияния в том числе кальция на поглощение этого препарата.
В течение 8 часов детектировали флуоресцентный сигнал.
Этот сигнал не наблюдался в случае, когда комплекс был связан с кальцием. На основании результатов наблюдения сделали вывод о том, что это связано с ослаблением способности кальция связывать DOX с последующим снижением поглощения этого комплекса.
Затем животные были умерщвлены и проводилось ex vivo исследование на органах после 10 часов перорального приема этого препарата с кальцием и без кальция.
Был сделан вывод, что флуоресцентный сигнал комплекса доксорубицина с кальцием в группе обнаруживается только в подвздошной кишке и желудке, а для группы животных, которым был введен препарат без кальция, флуоресцентный сигнал был явно больше в печени и почках, чем в подвздошной кишке.
Оптическая 3D-томография и ее особенности
Поговорим о том, за счет чего при использовании метода 3D-оптической томографии можно получить непревзойденную точность и подробные результаты.
Уже было сказано, что первые работы – in vivo исследования на мелких животных – проводились на обычных гель- и хемидокументирующих системах, на которых получали 2D-изображения.
При этом у исследователей не было понимания глубины сигнала, результаты были приближенными, а значит, данные могли быть неверно истолкованы.
При переходе к 3D-томографии сигнал реконструируется в объеме и перемещается в трехмерное представление мыши. За счет этого мы получаем более четкие сведения о локализации сигнала в теле животного и о его количественных характеристиках.
Как же реализуется в Newton 7.0 3D-оптическая томография?
В приборе есть 3D NIR-камеры, за счет которых исследователь получает 3D-представление о мыши – топографическое изображение, которое дальше будет использоваться. Затем основная CCD- камера получает несколько изображений сигнала с использованием различных эмиссионных фильтров с длинами волн в спектральном излучении люциферазы или введенных флуоресцентных молекулярных реагентов.
Потом сигнал реконструируется с помощью определенного алгоритма и помещается на созданное топографическое изображение животного.
Как это происходит?
На движущейся картинке – трехмерном изображении животного – с помощью программного обеспечения можно выбрать, добавить или скрыть отдельные органы или кости: пользователь ставит галочку, «включая» определенные органы или кости на модели.
Далее также можно создавать аксиальный, сагиттальный и корональный виды, чтобы оценить, где сосредоточен сигнал, и количественно определять этот сигнал в единицах объема с помощью программного обеспечения.
Вот как устроена камера (темная комната) внутри у прибора Newton 7.0 FT: в ней есть моторизованная камера и линзы по Z-оси, макромодули, все это рассчитано на 5 мышей. По осям X/Y есть моторизированный подогреваемый столик, позволяющий быстро изменить расположение образца.
По оси X есть моторизованные источники света.
Эта уникальная технология сканирования позволяет облучать полностью всю поверхность исследуемого животного, при этом все двигается: можно непосредственно менять положение мыши в пространстве. Все это позволяет получить более точный количественный подсчет флуоресценции.
Спектральные возможности системы Newton 7.0 FT
Прибор обладает полным спектральным диапазоном – это 8 каналов возбуждения (от 400 нм до 800 нм), в нем есть мощная лазерная подсветка класса II, нет никакой перекрестной стимуляции за счет того, что используются узкополосные фильтры. Можно увеличить чувствительность для получения изображений.
Программное обеспечение для системы Newton 7.0 FT
Соответственно, современное программное обеспечение позволяет редактировать изображение, анализировать его. Снимать данные можно в автоматическом, ручном и последовательном режимах, можно накладывать изображения и получать видео. Это ПО поставляется в комплекте с системой.
Среди других его возможностей следует отметить визуализацию изменения сигнала: изображения, которые получены во время различных сеансов, можно сгруппировать вместе, чтобы наблюдать последовательность, при этом можно построить временной ряд на основе изображений, полученных в разные дни эксперимента.
Программное обеспечение позволяет исследователю собирать, сравнивать эти изображения и получать картинки на протяжении всего курса лечения – обычно животное живет полтора месяца.
А затем можем воспользоваться режимом видеосъемки, когда последовательно снимаются много изображений и накладываются друг на друга – их можно просмотреть, как видео, сгруппировав соответствующим образом и выстроив с помощью ПО последовательность. В таком небольшом видеоролике будет видна динамика процесса – например, вы обратили внимание, как красным отмечено вещество, распределение которого изучается, и можно увидеть в созданной видеозаписи, как это вещество проходит по организму и где локализуется.
Анализировать изображения можно путем сравнения нескольких участков.
Результаты получаются в форматах .xls и .pdf нажатием одной кнопки, расчеты проводятся за секунду – в этом прибор очень удобен.
На слайде приведены научные работы, которые уже были сделаны на системе Newton 7.0 FT.
Варианты исполнения прибора и его стоимость
У системы Newton 7.0 FT Series есть несколько линеек.
Существуют приборы, дающие возможность работы с пятью мышами и одной мышью (Newton 7.0-FT100); есть система только для регистрации биолюминесценции (Newton 7.0-BT500) и система для регистрации как биолюминесценции, так и флуоресценции (Newton 7.0-FT500) – со всеми восемью источниками света и соответственно эмиссионными фильтрами.
Кроме этих четырех моделей, есть еще одна, Newton 7.0 BIO-FT500 позволяющая работать с растениями: у нее несколько отличается организация темной комнаты, включающей платформу с ротацией – она позволяет поворачивать растение.
Для примера: система Newton 7.0-FT500 для пяти мышей с регистрацией биолюминесценции и флуоресценции стоит 140 тыс. евро – по курсу на момент проведения вебинара это составляло 12 млн 658 тыс. рублей. В названную цену включено программное обеспечение и стоимость установки прибора, а также поддержка производителя: у «Диаэм» с ним прекрасный контакт, специалисты могут подключаться – есть доступ в реальном времени для решения каких-либо вопросов.
Если сравнить с конкурентами…
Следует обратить внимание, что системы от конкурирующих с Vilber производителей, представленные на рынке такого оборудования, включают рентген, тогда как система Newton – без рентгена. Ее производитель считает, что применение рентгенографии – это опасный метод, а потому предлагает технологию, которая дает отличные результаты без его использования, и этим стоит воспользоваться.
Если сравнивать 3D-томографию с рентгенографией, то стоит помнить, что это в принципе разные технологии визуализации, как, например, МРТ и КТ. Исследователь наблюдает визуализацию биолюминесцентной или флуоресцентной метки. При этом есть определенные ограничения для работы с головным мозгом, связанные с черепными костями как барьером.
В то же время рентген – это облучение, при этом в ряде задач рентгеновские снимки не покажут какие-то детали, например, не позволит досконально изучить сосудистую систему, отдельную клетку, посмотреть ex vivo результаты. На рентгене вы можете увидеть опухоль или изменение ее размера с течением времени.
С использованием же флуоресцентной метки можно отследить динамику, оценить молекулярные механизмы, тонко изучить локализацию, как мы наблюдали в экспериментах с кишечником. Оптическая томография позволяет больше увидеть и понять, в 3D отображении понять локализацию чего-либо в мягких тканях, оценить размер. Программное обеспечение позволяет проводить количественную оценку, получить сравнительную характеристику: например, на протяжении определенного времени можно измерять сигнал у одного объекта и получать количественный подсчет данных.
По сравнению с этой технологией у рентгена намного более ограниченный спектр задач, как и у КТ. Кроме того, у рентгеновских установок есть определенные ограничения по помещениям, где их можно использовать, в то время как оборудование Newton можно установить и использовать в любой лаборатории. Да и излучение при получении рентгеновских снимков – это дополнительная нагрузка на здоровье животного, особенно с учетом того, сколько снимков необходимо сделать при длительном эксперименте для получения данных в динамике.
Впечатляет и сравнение уровня цен. Например, единственная известная докладчику система с рентгенографией и 2D-оптической визуализацией от PerkinElmer уже 2 года назад в России стоила порядка 30 млн. рублей, то есть при существенно большей цене уровень безопасности и точности представления ощутимо ниже.
Все дополнительные вопросы о системе Newtom 7.0 FT от Vilber можно задать Анастасии Жиряковой по телефону 8-910-732-44-12 или по электронной почте az@dia-m.ru.
Новость о вебинаре «Оптическая томография как доклинический метод визуализации процессов in vivo в организме мышей и крыс. Примеры применения Newton в исследованиях в онкологии, фармакологии, наномедицине».