Генетическая паспортизация сортов растений необходима для защиты авторских прав селекционеров, контроля подлинности семенного материала, поддержания чистоты сорта и оценки генетического разнообразия коллекций . За последние десятилетия методологическая база паспортизации в мировой практике прошла путь от анализа запасных белков до исследования однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Рассмотрим основные методы, их преимущества и недостатки, а также современное состояние технологической базы в России.
Поскольку я имею опыт работы в молекулярной биологии в пом числе разработки маркерных систем для изучения генетического разнообразия линий кукурузы, а технически это выполняется так же как и паспортизация, только цели и финальное оформление различаются, то чувствую за собой моральное право рассказывать о ДНК- паспортизации.
Часть 1.
Белковые маркеры: первые шаги и их ограничения
Белковые маркеры (прежде всего запасные белки семян, такие как глиадины у злаков) стали первыми биохимическими инструментами для сортовой идентификации. В 1983 году метод был утвержден Международной ассоциацией по семенному контролю (ISTA) в качестве арбитражного . Однако с развитием молекулярной биологии стали очевидны существенные недостатки этого подхода.
Основные недостатки белковых маркеров
1. Экологическая нестабильность. Белки являются конечными продуктами экспрессии генов и частью фенотипа растения, поэтому их состав подвержен влиянию внешней среды . Исследования показали значительную погодичную изменчивость компонентов спектра:
- У сортов пшеницы изменчивость составляла 15-35%, у ячменя — от 20 до 94% .
- В экстремальные по погоде годы (например, холодные) изменчивость возрастала на 12-50% .
- У сортов вишни в благоприятный год число компонентов увеличивалось на 76% по сравнению с неблагоприятным .
2. Зависимость от условий выращивания. На состав и количество запасных белков влияют стрессовые факторы: недостаток питательных веществ (серы, азота), отклонения температуры. Это означает, что один и тот же сорт, выращенный в разных условиях, может показать разный белковый профиль .
3. Низкая разрешающая способность. Белковые маркеры выявляют лишь небольшую часть существующего генетического разнообразия. Только около 30% нуклеотидных замен могут быть обнаружены с помощью белкового маркирования, так как не каждая замена в ДНК приводит к замене аминокислоты .
4. Мономорфизм у родственных генотипов. У многих близкородственных сортов спектры запасных белков могут быть идентичными, что делает невозможной их дифференциацию .
5. Ограничения по стадии анализа. Для анализа используются преимущественно запасные белки семян, поэтому паспортизацию нельзя провести на стадии проростка или вегетирующего растения .
6. Формирование по материнскому типу. Спектры запасных белков формируются по материнскому типу, что затрудняет идентификацию гибридных форм .
В связи с этими недостатками белковые маркеры сегодня считаются устаревшим методом с низкой информативностью, и в современной практике они постепенно уступают место ДНК-технологиям. .
Часть 2.
RFLP-анализ: первый ДНК-маркер
RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) стал одним из первых ДНК-маркеров, который произвел революцию в генетическом картировании. Суть метода, если в двух словах, заключается в том что геномная ДНК разрезается специальным ферментом, (рестриктазой) в определенных местах (сайтах рестрикции) и далее полученные фрагменты разделяются с помощью электрофореза. Однако для рутинной паспортизации сортов метод имеет ряд недостатков.
Недостатки RFLP
1. Технологическая сложность. RFLP-анализ — многостадийный процесс, включающий выделение высокоочищенной ДНК, обработку рестриктазами, электрофорез, блоттинг (перенос на мембрану), гибридизацию с мечеными зондами и авторадиографию . Метод плохо поддается автоматизации.
2. Высокие требования к качеству ДНК. Требуется ДНК очень высокого молекулярного веса и чистоты.
3. Использование радиоактивной метки. Классический протокол подразумевает применение радиоактивно меченных зондов, что требует особых мер безопасности .
4. Низкая пропускная способность. Получение результата занимает дни и недели, что делает метод дорогим и непрактичным для массовой паспортизации .
5. Необходимость создания зондов. Для каждого маркера требуется специфичный ДНК-зонд, что представляет собой отдельную дорогостоящую работу .
Несмотря на высокую стабильность и кодоминантный тип наследования (позволяющий различать гомо- и гетерозиготы), RFLP оказался слишком сложным и медленным для рутинного применения в паспортизации сортов .
Часть 3.
Прежде чем перейти к рассмотрению конкретных типов маркеров, необходимо понять базовый метод, лежащий в основе большинства современных подходов, — полимеразную цепную реакцию (ПЦР) .
ПЦР — это метод амплификации (размножения) заданных фрагментов ДНК in vitro. Метод был разработан Керри Мюллисом, за что в 1993 году он получил Нобелевскую премию . Суть метода заключается в многократном копировании определенного участка ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Принцип ПЦР основывается на естественной репликации ДНК и включает повторяющиеся циклы из трех этапов :
1. Денатурация — нагревание ДНК до 90-95°С, при котором комплементарные цепи расходятся.
2. Отжиг праймеров — охлаждение до 40-60°С для присоединения коротких синтетических олигонуклеотидов (праймеров, длиной 15-30 нуклеотидов) к комплементарным участкам ДНК.
3. Элонгация — синтез новой цепи ДНК при 72°С с помощью термостабильной Taq-полимеразы.
За 20-35 циклов количество копий целевого фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии, достигая миллионов копий, что позволяет проводить дальнейший анализ . ПЦР легко автоматизируется с помощью специальных приборов — амплификаторов, относительно недорога и чрезвычайно специфична .
Часть 4.
RAPD-анализ: простота ценой надежности
RAPD-анализ (случайно амплифицированная полиморфная ДНК) привлек внимание исследователей своей простотой и низкой стоимостью. В методе используются короткие (около 10 нуклеотидов) праймеры со случайной последовательностью .
Критические недостатки RAPD
1. Невоспроизводимость результатов. Это самый серьезный недостаток метода. Результат крайне чувствителен к малейшим изменениям условий ПЦР: качеству и концентрации ДНК, типу полимеразы, концентрации ионов магния, режимам температурных циклов . Профили могут различаться не только между лабораториями, но и при повторении эксперимента в одной лаборатории.
2. Доминантный тип наследования. RAPD-маркеры не позволяют отличить гетерозиготное состояние от гомозиготного . Для паспортизации сортов, особенно гибридов, это критически важно.
3. Чувствительность к качеству ДНК. При использовании ДНК из сухих семян результаты часто нестабильны и противоречивы. Воспроизводимые результаты получаются только на свежих листьях проростков .
4. Гетерогенность профилей. RAPD-профили даже в пределах одного сорта могут быть неоднородными, что создает проблемы при оценке соответствия сорта критериям отличимости, однородности и стабильности .
5. Ограниченный таксономический диапазон. Метод имеет ограниченную применимость выше внутривидового уровня .
Несмотря на способность выявлять высокий уровень полиморфизма, нестабильность RAPD делает его непригодным для создания надежных генетических паспортов .
Часть 5.
SSR-маркеры: "золотой стандарт"
SSR-маркеры (простые повторяющиеся последовательности, или микросателлиты) стали логичным ответом на недостатки предшествующих методов. Они анализируют вариабельность коротких тандемных повторов (обычно 2-6 нуклеотидов) в геноме с использованием специфичных праймеров .
Преимущества SSR
1. Кодоминантный тип наследования. SSR-маркеры позволяют четко различать гомозиготные и гетерозиготные состояния, что дает полную картину генетической структуры сорта .
2. Высокая воспроизводимость. В отличие от RAPD, SSR-анализ дает стабильные результаты, которые легко воспроизводятся в разных лабораториях .
3. Высокий полиморфизм. Микросателлитные локусы чрезвычайно вариабельны. Например, при анализе 48 сортов малины с использованием всего 8 SSR-маркеров было выявлено 113 уникальных аллелей .
4. Возможность стандартизации. Для многих культур разработаны стандартизированные наборы SSR-маркеров. Для картофеля существует международный набор PGI (Potato Genetic Identity Kit), включающий от 8 до 14 маркеров, что позволяет сравнивать результаты, полученные в разных странах .
5. Доступность. SSR-маркеры экономически эффективны, просты в использовании и не требуют радиоактивных изотопов .
В рамках задач по паспортизации можно использовать мультиплексные наборы маркеров которые различаются цветом флуоресцентно меченных праймеров и размерами продуктов амплификации что позволяет одновременно анализировать до 10 маркеров. Применяемые для разделения полученных фрагментов ДНК-анализаторы имеют разрешающую способность до 1 основания.
Доступность оборудования:
Российская научно-производственная компания "Синтол" (основана в 1997 году выпускниками химического факультета МГУ) совместно с Институтом приборостроения РАН разработала отечественный секвенатор ДНК в рамках программы импортозамещения .
Генетический анализатор "Нанофор-05" — первый 8-капиллярный секвенатор российского производства. Он предназначен для:
- Секвенирования по Сэнгеру (de novo и ресеквенирование)
- Фрагментного анализа (микросателлитный анализ, LOH, AFLP)
- Исследования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)
Преимущества прибора:
- Открытость системы — позволяет работать с наборами для капиллярного электрофореза как отечественных, так и импортных производителей (Thermo Fisher Scientific, Promega, Qiagen)
- Низкая цена на расходные материалы за счет производства в РФ
- Короткие сроки поставки
- Быстрая техническая поддержка
- Русскоязычное программное обеспечение
Часть 6.
SNP-маркеры: современный стандарт
SNP-маркеры (однонуклеотидный полиморфизм) представляют собой маркеры последнего поколения, которые сегодня считаются наиболее совершенным инструментом для генетической паспортизации . SNP — это различия в последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C).
Преимущества SNP
1. Огромная распространенность в геноме. SNP встречаются в геноме очень часто — буквально миллионы таких маркеров можно найти у каждого вида. Это позволяет создавать панели из тысяч маркеров и получать уникальный, высокодетализированный "генетический портрет" сорта .
2. Кодоминантный тип наследования. Как и SSR, SNP позволяют различать гомо- и гетерозиготы.
3. Максимальная воспроизводимость. SNP-генотипирование дает исключительно стабильные результаты, легко сравнимые между разными лабораториями.
4. Высокая производительность и автоматизация. SNP-анализ идеально подходит для автоматизированных высокопроизводительных платформ (ДНК-чипы, NGS — секвенирование нового поколения).
Это позволяет анализировать тысячи образцов одновременно и снижать стоимость анализа при массовом использовании .
Ограничения SNP
1. Необходимость высокотехнологичного оборудования. Для полноценного использования SNP требуются сложные и дорогостоящие приборы (секвенаторы, ДНК-чипы) и высокая квалификация персонала.
2. Информационная сложность. Работа с огромными массивами SNP-данных требует развитой биоинформатической инфраструктуры для хранения, обработки и интерпретации результатов.
3. Сложность создания маркеров для сложных признаков. Невозможно создать ДНК-маркеры на такие признаки, как урожайность, качество семян и устойчивость к стрессам, поскольку они контролируются множеством генов и сильно зависят от условий среды.
Проблема импортозависимости в SNP-генотипировании в России
При всех преимуществах SNP-маркеров, их широкое внедрение в России сталкивается с серьезной проблемой — зависимостью от зарубежных поставок оборудования и расходных материалов.
Технология с использованием ДНК-микрочипов от американской компании Illumina — исключена, так-как из-за санкций и экспортных ограничений поставки прекратились .
Использование секвинаторов нового поколения для этого дорого как в плане стоимости оборудования так и с точки зрения стоимости 1 анализа. Кроме того это оборудование к сожалению в России не производится.
Вывод.
Не смотря на определенные технические преимущества методики основанной на SNP полиморфизме в текущих условиях она не является оправданным выбором так как:
1. Это поставит нас в зависимость от иностранных поставщиков.
2. Ведет к удорожанию анализа.
3. Стоимость оборудования и требования к квалификации кадров не позволят создать лаборатории в достаточном количестве
4. Исходя из выше перечисленного создаст не равные условия для участников рынка
P.S. паспортизация построена на поиске полиморфных участков генома. Маркеры должны быть равномерно распределены по геному. Источниками полиморфизма являются мутации. Есть 3 типа мутаций SNP однонуклеотидная замена. Может иметь два аллеля (некоторые считают что 4 то такое)), InDel вставка или пропуск одного или нескольких нуклиотидов в маркерной селекции используется для паспортизации не подходит из-за низкой плотности покрытия и малого количества аллелей иневозможности автоматизации, SSR тандемный повторяющийся мотив. Имеет много аллелей, по некоторым маркерам мы находили 7-8 аллельные варианты, а это означает высокую разрешающюю способность при меньшем количестве маркеров. Очень удобны для дальнейшей интерпретации и не требуют вычеслительных мощьностей для поступления анализа полученных результатов. Включать в ДНК-паспорт маркеры ассоциированные с определенными генами есть смысл только если вы создаете аналог существующей линии отличающийся только по 1-2 генам. Для оригинальных линий смысла нет.