Британские ученые разработали метод генной модификации большой восковой моли (Galleria mellonella) с использованием системы транспозонов PiggyBac и точного нокаута генов с помощью технологии CRISPR–Cas9. Создание этого метода позволит использовать моль в молекулярных исследованиях в качестве недорогой и совместимой животной модели. Описание метода приведено в журнале Lab Animal.
Личиночная стадия большой восковой моли (Galleria mellonella) все чаще используется в качестве модельного организма вместо млекопитающих, особенно в области изучения инфекций, иммунологии и воспаления. Личинки обладают широкой восприимчивостью к целому ряду важных с медицинской точки зрения микробов, а их способность поддерживать температуру 37 градусов Цельсия дает значительное преимущество перед другими модельными системами (например, плодовыми мушками или рыбками данио-рерио). Кроме того, в отличие от моделей позвоночных животных, к личинкам G. mellonella не предъявляются строгие этические требования.
В 2018 году ученые впервые описали геном большой восковой моли, что значительно увеличило потенциал животного в качестве альтернативной модели. Однако для G. mellonella не существует надежных методов генетических манипуляций, что ограничивает ее использование в области генетических исследований и генной инженерии.
Поэтому группа биологов под руководством Джеймса Уэйкфилда (James Wakefield) из Эксетерского университета разработала и описала метод создания трансгенных организмов G. mellonella. Для начала они выяснили в эксперименте с яйцами моли, что наиболее оптимальным временем для генетических манипуляций можно считать первые шесть часов после откладки яиц, поскольку в этот период развиваются стабильные трансформанты зародышевой линии.
Затем после ряда неудачных попыток группа Уэйкфилда выяснила, что плазмида pBmhsp90:hyPBase, которая кодирует гиперактивную транспозазу PiggyBac, успешно встраивается в ДНК моли и вызывает флуоресценцию. Из группы, получавшей эту плазмиду, были выделены трансгенные личинки, которые дали потомство от скрещивания с особями дикого типа.
Ученые стремились расширить возможности молекулярной инженерии G. mellonella, поэтому они протестировали систему CRISPR–Cas9 в отношении нокаута генов. Эмбрионам, гомозиготным по трансгенной кассете Bmhsp90:GFP/3xP3:DsRed, вводили смесь для инъекций, состоящую из одной гидовой РНК, нацеленной на последовательность egfp44, и Cas9, меченного красным флуоресцентным белком mCherry. Среди развивающегося потомства наблюдался целый ряд фенотипов с нокаутом зеленого флуоресцентного белка eGFP. Все взрослые особи G0 были скрещены с самками дикого типа, и половина полученного потомства обладала нокаутом нужного гена.
Эти результаты демонстрируют возможность как генной трансформации (с помощью PiggyBac), так и нокаута генов (с использованием CRISPR–Cas9) у большой восковой моли. Оба метода основаны на введении экзогенной нуклеиновой кислоты эмбрионам G. mellonella на начальной синцитиальной стадии развития. И хотя пропорции вылупления эмбрионов, их развития до окукливания и завершения созревания пока невелики, удачные случаи демонстрируют принципиальную возможность генетических модификаций вида.
О том, как органы-на-чипе пытаются заменить лабораторных животных, можно прочитать в материале «Чип спешит на помощь».