Эта публикация отражает содержание доклада «Внедрение новых методов синтеза с использованием системы NanoGenerator», прочитанного 20 сентября 2023 года.
Специалист компании Suzhou PreciGenome Брайан рассказал о новых путях применения липидных наночастиц и методах синтеза на их основе. Автор доклада обсудил историю создания, применение и преимущества липидных наночастиц, их текущее место на рынке и новые технологии синтеза на их основе. Он рассказал о применении таких технологий в медицине, о традиционных и новых путях синтеза наночастиц с использованием систем, выпускаемых компанией.
Общие представления о липидных наночастицах
Липидные наночастицы — это самособирающиеся надмолекулярные структуры на основе натуральных или синтетических липидов в водной среде. Их можно назвать передним краем нанотехнологий в области «защищенной транспортировки» терапевтических молекул, таких как лекарственные препараты или РНК, к месту их действия. Ученые, биотехнологи и специалисты в области медицины обратили вниманиена такие структуры благодаря пандемии COVID 19 и способности этих систем повышать биодоступность и эффективность лекарств путем усовершенствования их стабильности и направления их воздействия в нужные точки тела.
Липидная наночастица состоит из липидного двойного слоя, окружающего гидрофобное ядро. Такая структура позволяет частице инкапсулировать гидрофобные препараты или нуклеиновые кислоты, поддерживая гидрофильную составляющую на поверхности. Это делает их более стабильными и повышает совместимость с водной средой организма. . Исследователи могут даже модифицировать строение липидного двойного слоя и ядра для оптимизации стабильности, «грузоподъемности» (емкости, способности нести определенную дозу действующего вещества), высвобождения препарата и целевой специфичности в организме.
На схеме видны компоненты такой частицы: катионный / ионизируемый липид, структурный липид, холестерин, ПЭГ-содержащий липид, нуклеиновая кислота в виде полезной нагрузки. Эта структура и создается в микрофлюидном миксере.
Эти разносторонние наночастицы привлекли внимание исследователей благодаря своему потенциалу в области доставки мРНК и других типов РНК и лекарственных препаратов, каждый из которых обладает определенными терапевтическими преимуществами.
Другие примечательные пути применения липидных наночастиц связаны с CAR-T и генной терапией, о которой автор упоминал ранее.
Применение липидных наночастиц
Перейдем к актуальным путям использования липидных наночастиц и маркетологическим прогнозам, связанным с ними.
На слайде колонка слева отражает глобальные продажи геномных лекарственных препаратов на основе липидных частиц в 2021 году, а также прогноз на последующие 15 лет.
Мы видим, что в 2021 г. рынок таких систем составлял порядка 51 млн долларов, если говорить о 99 % вкладе вакцин на основе ДНК / РНК. Это ожидаемо с учетом тогдашней пандемии COVID-19 и того, что эти вакцины тогда были единственными среди одобренных FDA (Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США) терапевтических средств на основе ЛНЧ.
Однако в течение следующего десятилетия мы видим постепенный сдвиг к другим категориям технологий производства лекарств, таким как редактирование генома. Такое управление экспрессией определенных генов и редактирование генов и далее исследуется и развивается.
Мы видим большой провал после 2021 года: спрос на ДНК/РНК-вакцины против COVID-19 существенно снизился, а вслед за ним — и продажи.
В то же время исследования в области медицинских препаратов на основе ЛНЧ в генной терапии приближаются к выходу на рынок и получению одобрения FDA. Продажи генных препаратов показывают тенденцию к дальнейшему росту и в будущем. Мы видим на диаграмме прогнозируемые значения для препаратов, позволяющих добавить или заменить целевые гены, для управления экспрессией генов и для редактирования генов.Можно прогнозировать, что спрос на такие препараты почти сравняется со спросом на вакцины на основе ДНК и РНК против COVID-19 в 2021.
Следующие диаграммы отображают обзор лекарств на основе наночастиц для in vivo геномных препаратов по состоянию на декабрь 2021 года. Колонка А1 показывает долю препаратов на основе ЛНЧ, вышедших на конвейер и рынок. Видно, что даже к концу декабря 2021 это очень маленький процент продаваемых на рынке терапевтических препаратов, в то время как большинство таких препаратов находится на более ранних стадиях разработки и тестирования (фазы I–III исследований).
Диаграмма В описывает общее проникновение препаратов на основе липидных наночастиц в индивидуальную генную терапию, и при сравнении препаратов на основе наночастиц и на другой основе видно, что на основе липидных наночастиц производится совсем немного препаратов.
Наконец, диаграмма С показывает вклад в каждую категорию геномных препаратов на стадии разработки и вообще. Эта диаграмма показывает потенциал лекарств на основе ЛНЧ в будущем. Если сопоставить с данными из предыдущего слайда, уже можно увидеть, сколько исследований посвящено и ресурсов вложено в разработку генных препаратов на основе ЛНЧ. Могло бы и не быть их продаж сейчас, но они показывают многообещающие перспективы по части использования технологий.
Обратимся к примерам исследований
Первый пример — технология CRISPR-CAS 9 для лечения транстиретинового амилоидоза (ATTR-амилоидоза) — жизнеугрожающего заболевания, обусловленного накоплением в периферической нервной системе и внутренних органах деформированного амилоида (неправильно свернутого белка) на основе белка транстиретина (этот белок обеспечивает транспорт ретинола и тироксина).
В этом клиническом исследовании использовали NTLA-2001, чтобы нацелить его на TTR на первой фазе клинических исследований для оценки безопасности и эффективности препарата. Система генного редактирования NTLA-2001 позволяет исключить ген, экспрессия которого приводит к производству «неправильного» белка, и запустить производство правильного белка TTR.
Слева сверху на диаграмме видна схема действия NTLA на основе ЛНЧ. Эта липидная наночастица содержит мРНК для CAS-9 белка и гидовую (single guide) РНК, нацеленную на «неправильный» белок.
Анализируя нижние графики с результатами, можно увидеть, что редактирование гена TTR, усиленное работой мРНК для TTR, заключенной в наночастицу, приводит к снижению выработки неправильно свернутого белка, и это значит, что такая наночастицаспособна эффективно влиять на снижение синтеза этого неправильно свернутого белка путем замены гена на его «правильную» копию.
Этот эксперимент просто показывает эффективность нового пути применения наночастиц в генной терапии, не связанной с РНК/ДНК-вакцинами, а работающей с помощью замены гена.
Следующий пример связан с CAR-T клеточной терапией и новым способом применения липидных наночастиц при терапии повреждений сердца, специфичных для фиброза — такие заболевания могут угрожать жизни.
Фиброз характеризуется утолщениями или образованием рубцов, которые приводят к негативным последствиям для здоровья.
В этом исследовании использовались наночастицы, нацеленные на CD5 для создания Тклеток с антифибротическим химерным рецептором антигена, чтобы снизить проявления фиброза.
Рисунок D показывает, что 83 % T-клеток экспрессируют FAPCAR (антифибротический химерный рецептор антигена), достигающий своей цели после обработки наночастицами.
В верхней левой части можно видеть схему эксперимента.
На рисунке Е отображено, что CAR-T клетки, созданные с помощью технологии наночастиц, показали способность эффективно уничтожать целевые клетки, экспрессирующие FAP — белок активации фибробластов, in vitro пропорциональную дозе.
Это демонстрирует успех эксперимента и возможность перейти к исследованиям in vivo на мышах. Пример еще раз доказывает, что липидные наночастицы могут с пользой эффективно применяться не только для получения РНК/ДНК-вакцин — а на этот раз в форме CAR-T клеточной терапии.
Методы синтеза липидных наночастиц
Переходим к методам синтеза липидных наночастиц. Слева на рисунке можно увидеть традиционные методы создания липидных наночастиц, такие как гидратация тонких пленок, инъекция растворителя, метод экструзии. У каждого из этих методов свои преимущества и недостатки.
Так, шидратация тонких пленок — метод признанный и разноплановый, но требующий большого расхода органического растворителя, характеризуемый широким распределением по размерам получаемых частиц, недостаточной воспроизводимостью и масштабируемостью. Плюс требует дополнительного шага по снижению размера частиц.
Инъекция растворителя — это просто и быстро, метод управляемый и масштабируемый. Но при этом опять же дает большой разброс частиц по размерам, использует органический растворитель и имеет проблемы со стабильностью.
Экструзия — тоже известный метод, причем дает высокую однородность и однообразие формы продукта. Но при этом поры мембраны могут забиваться, а масштабируется метод плохо, он достаточно дорогой и трудоемкий.
Микрофлюидика для ЛНЧ
Сравним с тем, что предлагает микрофлюидика при синтезе липидных наночастиц по сравнению с традиционными методами.
Прежде всего нужно упомянуть высочайший уровень управления характеристиками наночастиц: размерами, зарядом поверхности, «полезной нагрузкой» (содержанием препарата). Это достигается за счет гибкой регулировки скорости потока и соотношения используемых реагентов. А значит, можно отрегулировать все параметры и характеристики частицы настолько, насколько этого требует цель. И такая точность, конечно, положительно отражается на эффективности терапии с использованием частиц, полученных по этой технологии. Микрофлюидика также с большей легкостью позволяет масштабировать процесс, при этом не происходит значительных потерь ресурсов. А значит, удельная стоимость производства целевых липидных наночастиц ощутимо снижается. В качестве минусов можно упомянуть разве что сложное производство (в смысле аппаратного обеспечения) и перспективу засорения микропор.
Механизм микрофлюидного синтеза липидных наночастиц завязан на точное управление потоками жидкостями в микромиксерах, где организовано хаотическоедвижение частиц с быстрым и тщательным их перемешиванием. В зависимости от задачи эти миксеры можно адаптировать по-разному: средняя часть слайда отображает разные подходы к геометрии и другим характеристикам процесса смешивания:
Слева вверху: Т-соединение — широко используемый способ, при котором потоки двух жидкостей взаимодействуют, сливаясь в форме буквы Т. Энергичное перемешивание происходит на границе раздела фаз.
Справа вверху — миксер «staggered herringbone» («шатающаяся елочка») использует специальные зубчатые бороздки, в которых формируются вторичные потоки, и в них поддерживается эффективное перемешивание.
Следующий тип миксера (слева внизу) — «разветвленный», бифуркационный, имеющий множество входов и выходов, в которых организовано перемешивание жидкостей, движущихся по сложной запутанной траектории с повторным раздвоением потоков и их последующим слиянием.
Миксер «Тесла» устроен по похожему принципу, основанному на разделении возникающих потоков, и является точно той технологией, которую генетики используют для своих микрофлюидных чипов.
Чтобы упомянуть ключевые параметры для смешивания в микрофлюидике, упомянем общую скорость потока, соотношение скоростей и тип насоса — все это существенно влияет на вид конечного продукта, то есть характеристику получающихся наночастиц.
Например, общий расход (общая скорость потока) определяет общую скорость и эффективность процесса смешивания. Коэффициент расхода (соотношение скоростей потоков) влияет на степень смешивания и итоговый состав смеси. Что касается типа насоса (шприцевой или пневматический), который проводит жидкость через устройство для формирования микрочастиц, то у каждого типа есть свои особенности, преимущества и ограничения.
Итак, подводя итог, отметим, что образование микрочастиц на основе хаотического смешивания жидкостей в микромиксерах позволяет гибко и эффективно управлять потоками жидкостей на микроуровне. Такая технология находит применение в разных направлениях, таких как создание наночастиц для создания систем каталогов (библиотек).
И дальнейшее усовершенствование и понимание принципов работы систем в микрофлюидике обладает потенциалом, способным произвести революцию в фармацевтике и биотехнологических исследованиях. Уже сейчас крупные компании, такие как Phizer, Moderna, используют или уже использовали технологию наночастиц для разработки своих мРНК-вакцин.
Наночастицы используются не только для крупномасштабных производств и целей, но и в микромасштабах в научно-исследовательских целей и фундаментальной науке в крупнейших университетах, таких как Массачусетский технологический университет. Это также позволило расширить применение технологии наночастиц с производства вакцин на основе нуклеиновых кислот до технологий редактирования генома, как и было показано выше.
Модельный ряд систем NanoGenerator
В завершение своего выступления автор представил оборудование для синтеза наночастиц — системы NanoGenerator Flex-S (для объемов 0.1–2 мл) и Flex-M (для объемов 1–12 мл) для обнаружения и скрининга.
NanoGenerator Pro с пропускной способностью 2–200 мл применим для скрининга и разработки, это полностью интегрированная система среднего размера, что прекрасно для доклинических исследований и промежуточного скрининга.
А системы NanoGenerator Max с пропускной способностью 1 л и Max+ с пропускной способностью более 10 л предназначены уже для клинических разработок в соответствии с требованиями GMP.
Кроме того, производитель предлагает индивидуальные решения для пользователя, для каких бы целей ему ни требовалось такое оборудование: возможно производство моделей с пропускной способностью свыше 20 л и возможностью скрининга 96 образцов за один запуск.
За дополнительной информацией по продукции PreciGenome следует обращаться по электронной почте info@precigenome.com или на сайт precigenome.com.