Эта публикация отражает содержание доклада «Сэнгер — жил, Сэнгер — жив, Сэнгер — будет жить… настоящее и будущее капиллярных генетических анализаторов», прочитанного на одноименном вебинаре 13 февраля 2024 года.
Введение: место Сенгера в современном секвенировании
Несмотря на стремительное развитие технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS), секвенирование по Сенгеру продолжает занимать важную долю — около 15–20% от всех применений секвенаторов в мире. Технологии второго поколения (NGS) и мономолекулярного секвенирования (Oxford Nanopore, PacBio и др.) сегодня лидируют, однако капиллярные секвенаторы по-прежнему востребованы. Их применяют как для определения последовательностей (секвенс), так и для фрагментного анализа — технологий, решающих широкий спектр задач.
Основы метода Сенгера: как это работает
Секвенирование по Сенгеру — это метод определения последовательности нуклеотидов ДНК. По своей сути, это односторонняя ПЦР-реакция с использованием одного праймера и флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов (терминаторов), которые случайным образом встраиваются в цепь и останавливают её удлинение. В результате образуются фрагменты ДНК разной длины, каждый из которых заканчивается меткой определенного цвета. Эти фрагменты разделяются по длине методом капиллярного электрофореза, и на основе флуоресцентного сигнала считывается последовательность.
Максимальная длина прочтения — до 800 пар оснований, а точность метода достигает 98% (1 ошибка на 100 нуклеотидов).
Этапы секвенирования
Процесс включает несколько ключевых стадий:
- ПЦР-амплификация
Для начала необходимо получить достаточное количество матрицы ДНК. Для этого используется амплификатор (термоциклер), например:Jinxplorer (Bayer Technologies, Китай) — шесть моделей с удобным тачскрином и элементами Peltier.
TurboCycler 2 и 3 (Blu-ray Biotech, Тайвань) — шесть моделей с удобным тачскрином и элементами Peltier. - Очистка ПЦР-продукта
Необходимо удалить праймеры и соли. Для этого используются:Наборы на колонках Diagen (50 и 250 реакций);
Магнитные частицы Магнофер (Беларусь), которые показали отличные результаты очистки. - Циклическое секвенирование
Применяются наборы реагентов:Классический BigDye Terminator (Applied Biosystems);
Российский аналог Novodai Terminator 3.1, полностью совместимый с приборами и спектральной калибровкой BigDye. - Очистка после секвенирования
Методы:Простой осадок спиртом (может ухудшать качество сигнала);
Наборы Exterminator, полностью совместимый с приборами и спектральной калибровкой BigDye.
Очистка магнитными частицами Deepure (Nemogen) или Магнофер.
Капиллярные секвенаторы и их устройство
Принцип работы
ДНК-цепи движутся в капилляре под действием электрического тока в полимерной среде. Проходя через окно детекции, меченые фрагменты возбуждаются лазером, и сигнал фиксируется камерой через оптическую систему. Это формирует электрофореграмму — график с пиками флуоресценции.
Оборудование
Классические приборы:
- Applied Biosystems 3500, 3730, SeqStudio — самые распространённые в РФ;
- SeqStudio Flex — гибрид, объединивший функциональность предыдущих поколений.
Альтернативы:
- Healthgene Technologies (Китай) — серия G (8, 16, 24 капилляра) и H16. Без RFID, с открытой системой и возможностью использовать нестандартизованные расходные материалы.
- Преимущества: капилляры на 36, 50, 80 см, оптоволоконная передача сигнала, высокая совместимость, удобный софт с русским интерфейсом.
Расходные материалы и совместимость
Для многих лабораторий важна доступность расходки к приборам, особенно к 3500 от ABI. Компания Диаэм предлагает:
- Полимеры Vostok 7 и 4 с RFID-метками;
- Буферные наборы Vostok с возможностью замены меток;
- Капилляры, планшеты (включая оригинальные и аналоги от Abclon, Sovtech);
- СЕПТЫ от Sovtech с регистрационным удостоверением;
- Формамиды (Applied, GTZ, белорусские) — только высокоочищенные, замороженные.
Примеры:
- Использование Vostok 7 с прибором 3500 показало отличные результаты при прочтении 400+ нуклеотидов, даже при очистке просроченными частицами.
- В комбинации с 3130 и 80-см капилляром получено прочтение более 900 нуклеотидов.
Калибровка и обслуживание
Для стабильной работы капиллярного секвенатора необходимы:
- Пространственная калибровка — при смене капилляра, открытии окна детекции или перемещении прибора;
- Спектральная калибровка — при смене набора красителей или капилляров другой длины, а также при снижении качества сигнала.
Программное обеспечение приборов Healthgene Technologies доступно на русском языке и предлагает удобную визуализацию результатов.
Заключение
Секвенирование по Сенгеру остается актуальным методом с высокой точностью и стабильностью. Компания Диаэм предлагает полный спектр решений: от оборудования и реагентов до расходных материалов и консультационной поддержки. В условиях ограниченного импорта это особенно важно — доступны отечественные и совместимые аналоги мировых брендов, а также поддержка при внедрении.
Страница вебинара Сэнгер — жил, Сэнгер — жив, Сэнгер — будет жить… настоящее и будущее капиллярных генетических анализаторов от 13 февраля 2024 года.