Первым в небо его поднял Михаил Громов, а позже многие летчики отмечали выдающиеся характеристики У-2. За 25 лет производства было построено примерно 40 тысяч самолетов. Благодаря своей простоте и надежности У-2 позволил наладить массовую подготовку пилотов.
В период Великой Отечественной войны У-2 применялся в роли ночного бомбардировщика, самолета связи, разведчика и санитарного транспорта.