Культивирование вируса африканской чумы свиней in vitro

Введение

Африканская чума свиней (АЧС) — это опасное инфекционное заболевание, вызываемое вирусом африканской чумы свиней. Заболевание характеризуется высокой температурой, сильным кровотечением и смертностью, приближающейся к 100 % в острых случаях. Оно привело к беспрецедентному кризису в сфере здоровья животных и продовольственной безопасности после недавнего всплеска заболеваемости, быстрого распространения по Азии и Европе и повторного появления в странах Карибского бассейна.Экономические последствия вспышек АЧС значительны и приводят к существенным потерям в производстве свинины и международной торговле.

Вирус АЧС — единственный представитель семейства Asfarviridae и единственный известный ДНК-содержащий арбовирус. Его большой и сложный геном, состоящий из 170–190 тысяч пар оснований и кодирующий более 150 белков, обусловливает сложность его взаимодействия с клетками-хозяевами.

Вирус африканской чумы свиней (АЧС) отличается специфическим тропизмом — он преимущественно инфицирует клетки моноцитарно‑макрофагальной линии. Эта избирательность создаёт существенные трудности для его размножения in vitro: стандартные клеточные линии обычно не обеспечивают эффективную репликацию вируса. Дополнительную сложность придаёт строение вириона — он имеет многослойную структуру и использует изощрённые механизмы уклонения от иммунного ответа хозяина, вмешиваясь в ключевые защитные пути.

Из‑за этих особенностей разработка субъединичных или инактивированных вакцин против АЧС пока остаётся затруднительной. В связи с этим особую значимость приобретают живые аттенуированные вакцины (LAV).

Исторически для культивирования вируса in vitro применяли свиные макрофаги — естественные клетки‑мишени возбудителя. Однако данный подход обладает рядом критических недостатков, ограничивающих его применение в крупномасштабном производстве вакцин и рутинных исследованиях:

• трудоёмкость и длительность получения и поддержания первичных культур макрофагов, сопровождающиеся низким выходом клеток;
• высокие затраты на приобретение свиней и обработку их тканей;
• этические ограничения, связанные с использованием животных;
• невозможность бессрочного поддержания культур, что исключает их применение для непрерывного промышленного производства;
• повышенная уязвимость к микробному заражению, способному скомпрометировать исследования и производственные процессы.

Таким образом, использование первичных клеточных культур в качестве производственной платформы стало серьёзным барьером на пути создания и широкого внедрения вакцин против АЧС.

В данном обзоре проанализированы альтернативные клеточные линии, исследованы молекулярные механизмы адаптации вируса к ним и оценена перспективность этих систем для разработки следующего поколения живых аттенуированных вакцин — безопасных и пригодных для масштабируемого производства.

Пути преодоления ограничений и поиск вакцинных платформ

1. Проблема первичных макрофагов свиней

Первичные макрофаги свиней — естественная мишень для вируса африканской чумы свиней (АЧС).

• максимально физиологически релевантны для изучения взаимодействия вируса с хозяином;
• играют ключевую роль в иммунном ответе;
• позволяют исследовать механизмы подавления интерферона I типа и иных защитных реакций.

Однако их применение ограничено рядом факторов: трудоёмкость и длительность получения культур; низкий выход клеток; высокая стоимость (закупка животных, обработка тканей); этические ограничения; невозможность долгосрочного поддержания; риск микробной контаминации.

Эти недостатки делают первичные макрофаги непригодными для масштабного производства вакцин и рутинной диагностики.

2. Альтернативные клеточные линии: несвиные системы

Исследователи активно изучают несвиные клеточные линии как платформы для репликации вируса АЧС.

Клетки почек обезьян

• Vero: адаптация вируса к этим клеткам часто ведёт к ослаблению вирулентности. Например, после 110 пассажей изолята Georgia 2007/1 наблюдалась полная аттенуация. Однако процесс сопровождается крупными геномными делециями и снижением репликации в первичных клетках.
• COS‑1/COS‑7: используются для детекции вируса, амплификации, создания мутантов и масштабируемого производства. Некоторые ослабленные мутанты показали потенциал как живые вакцины
• MA‑104 и субклон CA‑CAS‑01‑A: поддерживают репликацию полевого изолята с сохранением тропизма к макрофагам свиней. Адаптация привела к стабильной геномной линии ASFV‑MEC‑01 — кандидату в живые аттенуированные вакцины (LAV)
• MS и CV‑1: также применялись для адаптации, но с существенными геномными изменениями

Другие несвиные линии

• BHK‑21 (клетки почек хомяка): поддерживают репликацию штамма Тенгани после 137 пассажей
• HEK293T (клетки эмбриональной почки человека): низкая исходная восприимчивость, но эффективная репликация достижима через пассирование. Адаптация может влиять на вирулентность и иммуногенность

3. Свиные клеточные линии: баланс физиологии и масштабируемости

Эпителиальные клетки свиньи

• PIPEC (почки): эффективно поддерживают репликацию кандидата ASFV‑G‑ΔI177L/ΔLVR без геномных изменений при многократных пассажах

Клетки почки и гибридные линии

• PK, PSGK‑60, PPK‑66b, SPEV, LLC‑PK1: использованы для адаптации вирулентных штаммов
• A4C2 и A4C2/9k (гибридные): также применяются для ослабления вируса

Клетки дикого кабана

• WSL (лёгкие): поддерживают рост вирулентных и ослабленных штаммов с хорошей геномной стабильностью, но без явного цитопатического эффекта (затрудняет титрование)
• BK2258 (почки плода): эффективно реплицируют полевые и ослабленные штаммы с видимым цитопатическим эффектом

Иммортализованные макрофаги

• IPKM (почки): высокая чувствительность к вирулентным изолятам, но с геномными изменениями при производстве вакцин‑кандидатов
• IPAMs (альвеолярные): ограниченная восприимчивость к штаммам, но используются в разработке вакцин
• ZMAC‑4: поддерживают рост вирулентных и ослабленных штаммов, сохраняя защитный эффект после пассажа
• IPIMs (кишечные): реплицируют различные штаммы АЧС

4. Методы адаптации вируса: серийные пассажи и генетическая инженерия

Серийное пассирование
Этот метод предполагает многократное заражение свежих клеток потомством вируса. В результате возрастает титр и кинетика репликации, накапливаются генетические изменения (делеции, вставки, однонуклеотидные полиморфизмы), происходит отбор вариантов с полезными мутациями (например, в генах, отвечающих за уклонение от иммунитета).

Геномные изменения при адаптации

• Левая вариабельная область (ЛВО) и мультигенные семейства: частые делеции, влияющие на вирулентность и иммунный ответ.
• Ген EP402R (белок CD2v): мутации изменяют гемадсорбцию и клеточный тропизм.
• Гены A137R и I177L: потенциальные мишени для рациональной аттенуации.

Современные технологии

• Синтетическая геномика и обратная генетика: позволяют точно модифицировать геном вируса (например, система TAR в дрожжах).
• CRISPR/Cas9: повышает точность целевых изменений, минимизируя побочные эффекты.
• 3D‑культуры: имитируют in vivo условия, улучшая прогнозируемость аттенуации.
• Иммортализованные макрофаги с контролируемой экспрессией факторов хозяина: обеспечивают стабильное производство вируса с высоким титром.

5. Безопасность и стабильность LAV: ключевые вызовы

Риск возврата вирулентности
Ослабленные штаммы могут восстанавливать патогенность при пассаже in vivo. Примеры: ASFV‑G‑ΔI177L: мутации в гене C257L связаны с возвращением вирулентности. Рекомбинационно‑опосредованная репарация: восстанавливает удалённые последовательности или генерирует компенсаторные мутации.

Методы оценки стабильности

• Глубокое секвенирование: выявляет малочастотные вирулентные варианты.
• Транскриптомный анализ: отслеживает изменения в экспрессии генов.
• Функциональные тесты: оценивают ингибирование интерферона и модуляцию апоптоза.
• Совместное культивирование с несколькими типами клеток: имитирует давление отбора in vivo.
• Вычислительное моделирование: прогнозирует стабильность штаммов с помощью ИИ и машинного обучения.

6. Перспективы разработки вакцин

Для создания безопасных и эффективных LAV необходимо:

1. Обеспечить баланс между аттенуацией и иммуногенностью
2. Гарантировать генетическую стабильность штаммов
3. Использовать мультидисциплинарные подходы (in vitro, in vivo, in silico)
4. Соблюдать стандарты GMP для масштабируемого производства

Будущее борьбы с АЧС во многом зависит от успешной разработки и внедрения безопасных, эффективных и доступных вакцин. Как подробно описано в этом обзоре, использование непрерывных клеточных линий для производства вакцин является наиболее перспективным направлением, поскольку оно даёт значительные преимущества по сравнению с использованием первичных макрофагов свиньи с точки зрения масштабируемости, стабильности, стоимости и этичности. Конечная цель состоит в том, чтобы объединить рациональный подход к разработке исключительно безопасных вакцин на основе живых аттенуированных вирусов с современными надёжными производственными платформами.

Несмотря на то, что остаются нерешёнными важные задачи, в частности обеспечение генетической стабильности для предотвращения возврата к вирулентности и разработка вакцин, обеспечивающих широкую перекрёстную защиту от различных генотипов вируса восточного конского гриппа, недавние прорывы в технологии производства открывают новые возможности.Важным достижением является значительный прогресс в адаптации стабильных клеточных линий к бессывороточным химически определённым средам и суспензионным культурам.

Это достижение не только снижает производственные затраты и вариативность, но и является важным шагом на пути к соблюдению строгих требований надлежащей производственной практики (GMP) при коммерческом производстве вакцин. Благодаря сочетанию этих инновационных методов производства со всё более сложными стратегиями разработки вакцин мы приближаемся к тому, чего давно ждали: к созданию доступной во всём мире вакцины против АЧС, которая в конечном счёте поможет контролировать это разрушительное заболевание.

Оригинальная статья: BioMed Central Ltd