Продолжим изучать детали хроматографического процесса- ознакомимся с моделью разделения и с параметрами, с которыми приходится работать хроматографисту.
Хроматографический процесс
Чтобы понять, как работает хроматография, полезно представить себе, что в колонке происходит множество мелких процессов разделения, и все они повторяются снова и снова. Один из наглядных способов объяснить это — модель машины Крейга, которая представляет собой каскад миниатюрных сосудов, между которыми жидкость и газ многократно обмениваются веществами. Хотя эта модель не отражает всех деталей реальной хроматографии, она помогает интуитивно понять, как именно вещества разделяются внутри колонки.
Принцип действия
Представим, что хроматографическую колонку можно мысленно разделить на ряд маленьких «реакторов» или ступеней равновесия. В каждом из них между подвижной и неподвижной фазой устанавливается равновесие — часть молекул растворяется в неподвижной фазе, а часть остаётся в подвижной.
Когда поток подвижной фазы движется дальше, он переносит с собой молекулы, не успевшие задержаться, а те, что сильнее взаимодействуют с неподвижной фазой, временно остаются позади. На следующей ступени процесс повторяется — снова устанавливается равновесие, снова происходит перенос.
Такое многократное повторение равновесных стадий и обеспечивает постепенное разделение компонентов смеси. Даже если разница между веществами небольшая, накопление эффекта после сотен или тысяч таких микропроцессов делает разделение весьма эффективным.
Пример условной модели
Для простоты представим, что мы вводим в систему смесь из двух типов молекул — «белых» и «чёрных».
Белые молекулы слабо взаимодействуют с неподвижной фазой и быстро перемещаются вместе с потоком подвижной фазы. Чёрные молекулы, наоборот, частично задерживаются — часть из них остаётся в неподвижной фазе, а часть продолжает движение.
Этап 1. Ввод пробы
На первом рисунке в систему вводят смесь из 16 белых и 16 чёрных молекул.
Белые — это вещество, которое не взаимодействует с неподвижной фазой, чёрные — частично удерживаются.
В первом реакторе начинается установление равновесия между газовой (G) и жидкой (L) фазами.
Этап 2. Первое перераспределение
Подвижная фаза (газ) из первого реактора переносится во второй.
Белые молекулы перемещаются полностью, а часть чёрных остаётся в неподвижной фазе.
Таким образом, уже после первой стадии концентрация чёрных молекул в первом реакторе уменьшается, но полностью они не уходят.
Этапы 3–4. Многократные равновесия
Процесс повторяется для следующих реакторов.
На каждом этапе часть вещества переходит вперёд, часть задерживается.
Белые молекулы постепенно «убегают» вперёд, тогда как чёрные всё время частично остаются.
В результате по длине системы формируется зона распределения, где концентрация веществ постепенно меняется.
Этап 5. Формирование пиков
После нескольких десятков циклов перераспределения профиль концентраций двух веществ приобретает форму гауссовых пиков — у белых молекул пик оказывается ближе к выходу (меньшее время удерживания), у чёрных — дальше (большее время удерживания).
На хроматограмме это выглядит как два отдельных пика, что и означает успешное разделение смеси.
Смысл модели Крейга – проиллюстрировать, что хроматографическое разделение — это не одномоментный процесс, а результат многократного установления равновесий между фазами. И чем больше таких этапов, тем качественнее (эффективнее) происходит процесс разделения, о чем мы поговорим в следующих публикациях.
Параметры удерживания
После ввода пробы в систему и старта анализа, начинает фиксироваться хроматограмма — график, показывающий, как разные вещества проходят через колонку хроматографа после их ввода в систему и испарения. На ней можно измерить время удерживания (tR) — промежуток от момента ввода пробы до появления максимума сигнала анализируемого вещества (пика) на графике. Каждый пик соответствует определённому веществу.
Главное, что влияет на время удерживания, — это сила межмолекулярного взаимодействия вещества с неподвижной фазой, то есть с материалом, который находится внутри колонки и не движется. Если вещество сильно «прилипает» (удерживается) к этой фазе, оно движется медленнее, и пик появляется позже. Если же оно слабо взаимодействует и обладает высокой летучестью (легко испаряется), то выходит из колонки быстрее, и пик фиксируется раньше.
Например, при анализе смеси спиртов в газовом хроматографе метанол (самый лёгкий и летучий спирт) выйдет первым — его пик появится ближе к началу хроматограммы. Этанол и пропанол задержатся чуть дольше, а бутанол — самый «тяжёлый» из них — появится последним, так как его молекулы сильнее взаимодействуют с неподвижной фазой.
На время удерживания влияют не только свойства вещества и неподвижной фазы, но и параметры самой системы — длина колонки и скорость потока подвижной фазы:
Если колонка длиннее, путь вещества увеличивается, поэтому время удерживания становится больше. Если поток подвижной фазы движется быстрее, вещество достигает детектора раньше, и время удерживания уменьшается. Таким образом, при одинаковых условиях можно сказать, что время удерживания пропорционально длине колонки и обратно пропорционально скорости потока.
В отличие, например, от спектрофотометрии, где важен мгновенный сигнал детектора, в хроматографии учитывается динамика прохождения анализируемого вещества. Поэтому основным аналитическим параметром служит площадь под пиком на хроматограмме — она отражает общее количество вещества, прошедшего через детектор за всё время анализа.
Высоту пика иногда тоже используют, но только если пики симметричные и узкие, без искажений формы. При наличии растянутых или смещённых пиков площадь остаётся более надёжным показателем.
Ширина пика — важная характеристика, показывающая, насколько «растянут» сигнал во времени. Обычно её измеряют как длину участка между точками пересечения касательных, проведённых через точки перегиба пика.
В идеальных условиях хроматографический пик должен иметь гауссову форму — симметричную, похожую на колокол.
Если пик искажён (например, имеет «хвост» или «задир»), это указывает на нелинейную сорбцию или проблемы с разделением веществ. В результате зоны веществ могут перекрываться, что снижает точность анализа.
Чтобы оценить, насколько пик соответствует гауссовой форме, сравнивают ширину пика у основания с шириной на половине его высоты. Для идеально гауссового пика выполняется соотношение:
ширина у основания = 1,698 × ширина на половине высоты.
На практике пик считают достаточно близким к гауссовому, если это значение находится в пределах от 1,67 до 1,73. Для оценки степени асимметричности пика используют коэффициент асимметрии, который вычисляется как отношение левой полуширины пика к правой на одной десятой его высоты.
· As ≈ 1 — пик симметричный (идеальный).
· As > 1 — пик «тянется» вправо (хвост).
· As < 1 — пик «завален» влево.
Асимметрия может указывать на проблемы в колонке или сильное взаимодействие между компонентом и фазой.
Если компонент не удерживается в колонке, то фиксируется дополнительный параметр – Мертвое или нулевое время. Экспериментально мертвое время определяют от момента ввода пробы несорбируемого вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора.
Разность между временем удерживания и мертвым временем дает следующий дополнительный параметр – Приведенное время удерживания.
Этот показатель учитывает только ту часть хроматографического тракта, где вещество реально взаимодействует с неподвижной фазой.
Одним из ключевых параметров в хроматографии является фактор удерживания (по терминологии IUPAC — также известен как фактор ёмкости или коэффициент распределения массы). Он определяется как отношение приведённого времени удерживания к мёртвому времени.
Фактор удерживания показывает, во сколько раз вещество дольше находится в неподвижной фазе, чем в подвижной. Проще говоря, это мера способности колонки удерживать компоненты смеси. Этот параметр является безразмерной величиной и используется для сравнения свойств различных веществ и условий разделения.
· Если k слишком мал (< 1), вещество почти не удерживается.
· Если k слишком велик (> 10), вещество задерживается слишком сильно, и анализ затягивается.
· Оптимальные значения обычно — от 1 до 5.
Кроме того, важным показателем считается константа распределения, представляющая собой отношение концентрации вещества в неподвижной фазе к его концентрации в подвижной. Чем выше это значение, тем медленнее компонент движется по колонке. При повышении температуры колонки равновесие смещается в сторону подвижной фазы, поэтому в газовой хроматографии константа распределения сильно зависит от температуры.
Но о ней и о других параметрах, мы поговорим в следующих публикациях. Будьте на связи и задавайте вопросы.