В предыдущей публикации мы детально разобрали особенности ввода пробы с делением потока. Теперь логичным шагом будет перейти к изучению режима без деления потока (splitless), который открывает новые возможности для анализа микропримесей.
В splitless-режиме образец полностью переходит в колонку. Протяженность этапа (сотни миллисекунд) может приводить к значительному уширению начальных хроматографических зон. Для компенсации этого применяются три приема:
· Эффект растворителя (сольвентинг)
· Термическое фокусирование (криофокусирование)
· Сорбционное фокусирование на неподвижной фазе.
Преимущество splitless-ввода заключается в 100% переводе образца в колонку, что кардинально увеличивает чувствительность метода по сравнению с режимом с делением потока. Данная особенность предопределила широкое применение этого подхода для анализа микропримесей и следовых количеств соединений.
Наиболее эффективно метод применяется для колонок диаметром 0.53 мм, реже - с 0.32 мм, что объясняется большей ёмкостью таких колонок и оптимальными условиями для фокусирования пробы.
В splitless-режиме критически важно обеспечить эффективное фокусирование пробы на входе в капиллярную колонку. При этом наблюдается два типа размывания начальной зоны: временное и пространственное.
Поскольку процесс переноса паров пробы из испарителя протекает за несколько десятых долей секунды, наблюдается временное размывание. Кроме того, аналиты распределяются по начальной части колонки, вызывая пространственное размывание хроматографической зоны. Ключевое различие между этими явлениями - при временном размывании вещества распределяются согласно их временам удерживания, тогда как при пространственном - равномерно по длине колонки.
При отсутствии фокусирования указанные явления приводят ухудшению формы и увеличению ширины пиков. Для минимизации временного размывания применяются два основных метода: фокусирование растворителем (сольвентинг-эффект) и термическое фокусирование ("холодное улавливание", cold trapping). Данные подходы обеспечивают концентрирование аналитов в узкую стартовую зону до начала процесса хроматографического разделения.
Конструкция пневматической схемы в хроматографах «Хроматэк-Кристалл» накладывает техническое ограничение на использование режима splitless. Это ограничение касается конфигураций, где на линии сброса пробы установлен регулятор давления.
Если конструкция испарителя не включает дополнительный клапан-отсекатель, то в процессе инжекции без деления значительная часть пробы может попасть в канал сброса. Впоследствии, при выравнивании давления в испарителе, эти аналиты вымываются из системы и не попадают в колонку, что приводит к снижению чувствительности и воспроизводимости анализа.
Для минимизации объёма канала сброса в систему устанавливается дополнительный клапан-отсекатель, а после инжекции пробы выполняется процедура продувки (вентилирования).
Эффект растворителя (сольвентинг-эффект)
Сольвентинг-эффект реализуется, когда температура колонки установлена приблизительно на 30C ниже температуры кипения используемого растворителя. При соблюдении этого условия пары растворителя конденсируются в начале колонки, где удерживаются неподвижной фазой. При конденсации растворителя жидкостная пленка функционирует как дополнительный утолщенный слой фазы, что обеспечивает эффективное улавливание и последующее фокусирование летучих аналитов.
Растворитель создает своеобразный барьер, предотвращающий размывание хроматографической зоны. Сконденсированная пленка растворителя формирует в начале колонки область с низким фазовым отношением β, определяемым как отношение объема подвижной фазы (Vп.ф) к объему неподвижной фазы (Vн.ф). Снижение фазового отношения приводит к увеличению коэффициента удерживания и эффективному фокусированию аналитов в узкой стартовой зоне.
Уменьшение фазового отношения β приводит к пропорциональному увеличению коэффициента ёмкости k:
В начале колонки происходит эффективное концентрирование аналитов. После завершения переноса пробы из испарителя в колонку активируется продувка и начинается программированный подъем температуры колонки. Сконденсированный растворитель испаряется, что инициирует начало хроматографического разделения. Благодаря предварительному фокусированию, анализируемые вещества образуют узкие стартовые зоны, что обеспечивает высокое разрешение пиков на хроматограмме. Данный процесс позволяет значительно улучшить форму пиков и повысить чувствительность определения, особенно при работе с следовыми количествами аналитов.
Процесс фокусировки растворителем осуществляется в два последовательных этапа:
Пары растворителя конденсируются из газообразного состояния в жидкую фазу;
При последующем повышении температуры колонки растворитель медленно испаряется.
Пространственное размывание зон представляет собой прямое следствие механизма фокусировки с использованием растворителя. Несмотря на эффективную компенсацию временного размытия, конденсированный растворитель формирует в начале колонки (первые несколько сантиметров) избыточно толстый и термодинамически нестабильный слой. Под воздействием газа-носителя данная "пробка" растворителя мигрирует вдоль колонки, образуя протяженную увлажненную зону.
Значительное пространственное размывание возникает вследствие распределения аналитов по всей длине смоченной зоны. При этом ширина результирующей зоны напрямую определяется шириной области, занятой растворителем. Для пробы объемом 1 мкл длина зоны смачивания достигает 20-30 см при условии полного покрытия неподвижной фазы растворителем. Для неполярных стационарных фаз (диметилсиликон) применяют изооктан, для полярных фаз (например, полиэтиленгликоль) используют этилацетат
При работе со колонками (длина 25-30 м, внутренний диаметр 0,32 мм) и указанном объеме пробы ухудшение формы пиков может не проявляться благодаря высокой эффективности колонок. Однако детальный анализ хроматограмм, включающий оценку симметрии и эффективности разделения, позволяет идентифицировать признаки пространственного размывания.
Фокусирование зоны с применением пустого капилляра (Retention Gap)
Метод фокусирования с пустым капилляром (Retention Gap, RG) применяется для подавления пространственного размывания анализируемой зоны. Данный подход реализуется с помощью начального участка колонки, не содержащего неподвижной фазы. В этой инертной зоне коэффициенты удерживания (k) для всех компонентов пробы близки к нулю.
Процесс осуществляется в два этапа: сначала испаряется растворитель, затем все аналиты из смоченной области транспортируются в секцию с неподвижной фазой. На заключительном этапе происходит их удерживание и фокусирование в компактную стартовую зону, что оптимизирует процесс хроматографического разделения.
Процедура включает три этапа:
Этап 1: Миграция растворителя и аналитов от тыльной к фронтальной части смоченной зоны. Этап 2: Фокусирование на неподвижной фазе, возможное только когда k аналитов > k растворителя. Этап 3: Фокусирование растворителем, для которого k аналитов должно превышать k растворителя в 1-5 раз.
Длина пустого капилляра (0,5-1,0 м для пробы 1-2 мкл) подбирается исходя из длины смоченной зоны, которая зависит от объема пробы и типа растворителя.
Подбор температуры
Для эффективного применения фокусировки критически важен тщательный подбор температурных режимов — как температуры испарителя, так и начальной температуры колонки.
Испаритель: температура должна быть достаточно высокой для мгновенного испарения образца, но исключающей термическое разложение аналитов. Это критически важное условие и для режима со сбросом пробы, и для режима без сброса.
Программирование термостата колонок требует более тонкой настройки. Для активации сольвентинг-эффекта (фокусирования растворителем) необходимо установить низкую температуру, обеспечивающую конденсацию паров растворителя после ввода образца. Начальная температура термостата колонок устанавливается как минимум на 30C ниже температуры кипения применяемого растворителя.
Рекомендации по вводу проб без деления потока
· Для количественного анализа в splitless-режиме применимы методы стандартной добавки и внутреннего стандарта. Критически важным условием является воспроизводимость объема ввода образца (обычно 1-2 мкл).
· Повторяемость объемов ввода является критически важным условием для обеспечения стабильных времен удерживания.
· Применение автоматических дозаторов позволяет существенно повысить воспроизводимость как времен удерживания, так и итоговых количественных результатов анализа.
· Летучие соединения (tкип< 150C) анализируют с использованием сольвентинг-эффекта для сужения зоны. Высококипящие вещества требуют применения холодного улавливания. Для неизвестных проб оба метода комбинируют путем температурного программирования.
· Для корректной реализации сольвентинг-эффекта термостат колонок следует установать на 20-30C ниже температуры кипения применяемого растворителя.
· При выполнении ручного ввода пробы предпочтительно использовать метод ввода горячей иглой. Скорость ввода пробы при этом не должна превышать 1-2 мкл/с.
· Температуру испарителя следует подбирать в соответствии с характеристиками пробы: для большинства анализов достаточно диапазона 200-280C, для анализа «грязных» проб может потребоваться нагрев до 300C.
· Необходимо обеспечить регулярную очистку испарителя.
· Скорость потока газов-носителей (гелий, водород) должна поддерживаться на уровне не менее 2 мл/мин.
· Целесообразно использовать увеличенное время продувки (50-80 с) вместо стандартного (20-40 с).
· Splitless-режим не следует применять, если компоненты образца удерживаются слабее, чем растворитель — это приводит к искажению формы пиков из-за явления частичного улавливания растворителем.
· Для улучшения формы пиков при работе с полярными растворителями рекомендуется использовать эффект концентрирования в пустом капилляре.
Наши инженеры всегда на связи, чтобы помочь вам с выбором режима ввода пробы и оптимизацией ваших методов. Не останавливайтесь на достигнутом — улучшайте точность и чувствительность ваших анализов вместе с нами!
Следите за новостями! В следующей статье разберем прямой ввод и ввод большого объема (LVI). Это то, что нужно для работы со сложными и «грязными» пробами.
