(Портреты. «ХиЖ» 2020 №9)
29 сентября родился Питер Митчелл (1920–1992). По этому поводу повторяем статью, приуроченную к 100-летию со дня рождения этого выдающегося английского биофизика, удостоенного Нобелевской премии 1978 года за раскрытие механизма синтеза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) при дыхании.
Молекула-аккумулятор
Жизнь требует совершения самой разнообразной работы. А работа требует энергии. Источник энергии для животного — съеденная им пища, которая окисляется в организме до воды и углекислого газа. Для растения — органические вещества, образовавшиеся при фотосинтезе за счет солнечной энергии. Эти вещества также окисляются кислородом до углекислого газа и воды. Этот процесс окисления органических веществ принято называть дыханием. Да, совершенно верно: с точки зрения биохимика, дыхание — это не вдохи и выдохи, а совокупность реакций, необходимая для превращения углеводов, жиров и аминокислот в углекислый газ и воду с запасанием высвобожденной энергии. Где и как она запасается?
В начале 1940-х годов немецко-американский биохимик Фриц Лимпан (1899–1986) высказал мысль о том, что энергия, выделяющаяся при дыхании, не сразу используется для выполнения какой-либо работы. Она идет на зарядку биологических аккумуляторов, и уже за счет этой запасенной энергии выполняется необходимая живым организмам работа. Точно так же дизельная подводная лодка заряжает аккумуляторы в надводном положении и двигается за счет запасенной в них энергии под водой. Если бы дизельное топливо сжигалось во время подводного плавания, то экипаж задохнулся бы.
Фриц Лимпан привел свидетельства того, что заряженным биологическим аккумулятором являются молекулы АТФ — аденозинтрифосфорной кислоты (или аденозинтрифосфата, потому что в богатой катионами внутренней среде организма все кислоты превращаются в соли). Они синтезируются из молекул аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) путем присоединения фосфата. Эта реакция идет с поглощением большого количества энергии и может рассматриваться как зарядка аккумулятора. Обратная реакция расщепления АТФ на АДФ и фосфат сопровождается выделением энергии, которая и используется для совершения разнообразных работ в клетке.
АТФ открыли в 1929 году независимо две группы исследователей: Сайрус Фиске и Йеллапрагад Суббарао в США и Карл Ломан и Отто Мейергоф в Германии. В начале 1930-х годов работавший в Казани Владимир Александрович Энгельгардт показал, что при клеточном дыхании синтезируются соединения, которые чуть позже были идентифицированы как АТФ. В 1949 году знаменитый американский биохимик Альберт Ленинджер установил, что дыхание и связанный с ним синтез АТФ происходят в митохондриях — внутриклеточных органеллах, окруженных двумя мембранами.
Таким образом, главный результат дыхания (окисление органических веществ в клетках) — запасание энергии в виде АТФ. А в 1954 году Даниэль Арнон показал, что АТФ синтезируется и при фотосинтезе. С середины 1950-х годов стало общепринятым представление об АТФ как универсальном аккумуляторе энергии. На свет появилась новая область биологии — биоэнергетика. Просьба не путать ее с учениями об ауре, телекинезе и биополе: биоэнергетика нормального человека — наука об энергетических процессах в живой клетке, главным образом о превращениях АТФ.
Что такое окислительное фосфорилирование
В 1930–1940-х годах были расшифрованы механизмы разложения главного топлива живых организмов — глюкозы. На первом этапе из одной молекулы глюкозы (С₆Н₁₂О₆) образуются две молекулы молочной кислоты (С₃Н₆О₃). При этом синтезируются две молекулы АТФ.
У дрожжей вместо молочной кислоты образуются этиловый спирт и углекислый газ, у разных бактерий возможны и другие варианты. Но в любом случае в первом этапе не участвует кислород и не происходит окислительно-восстановительной реакции.
На втором этапе молочная кислота окисляется до углекислого газа с помощью универсальных окислителей-восстановителей (УОВ). Будем называть их так для простоты: это три разные молекулы, сокращенно обозначаемые НАД, НАДФ и ФАД, причем, например, НАДФ расшифровывается как «никотинамидадениндинуклеотидфосфат».
Уравнение записывается следующим образом:
С₃Н₆О₃ + 3УОВ + 3Н₂О = 3СО₂ + 3УОВ · H₂,
УОВ и УОВ · H₂ — соответственно окисленная и восстановленная форма универсальных окислителей-восстановителей. Попутно образуется одна молекула АТФ.
На этом разложение органических веществ заканчивается, и начинается главный этап клеточного дыхания, который принято называть окислительным фосфорилированием. Окисление УОВ · H₂ кислородом
2УОВ · H₂ + О₂ = 2УОВ + 2Н₂О
сопровождается образованием большого количества АТФ (то есть присоединением фосфатов к АДФ, поэтому «фосфорилирование»). При полном окислении одной молекулы глюкозы кислородом образуется 38 молекул АТФ, из них 34 молекулы — при окислении кислородом восстановленной формы УОВ.
Окисление прочих органических веществ в клетке (аминокислот, других углеводов, липидов и т.д.) происходит по тому же принципу: сначала универсальные окислители-восстановители без участия кислорода окисляют их до углекислого газа, а затем восстановленные формы окислителей-восстановителей окисляются кислородом с образованием АТФ.
Написать уравнения легко, но разобраться, как устроена на клеточном и молекулярном уровне фабрика, производящая АТФ, было очень непросто. Именно за расшифровку механизма главного этапа клеточного дыхания, основного источника энергии в живой клетке, — окисления УОВ · H₂ с образованием АТФ — Питер Митчелл и получил Нобелевскую премию.
Человек, который построил себе институт
Питер Митчелл родился в 1920 году в Митчеме (графство Суррей) в семье государственного служащего. Дядя Питера Годфри Митчелл был крупным предпринимателем, и его помощь обеспечивала семье безбедную жизнь. Биографы отмечают, что в детстве будущий нобелевский лауреат увлекался механическими устройствами и экспериментами. Мать привила ему склонность к музыке, а отец — к математике. С годами отношения между родителями ухудшались, и Питера с братом решили отдать в закрытые школы, чтобы избавить от участия в семейных сценах. Питера в 1931 году отправили в Куинс-колледж в Таунтоне, где была возможность изучать инженерное дело и естественные науки. У него сложились хорошие отношения с директором, который поощрял его увлечения математикой и музыкой. Но юный Питер интересовался не только любимыми предметами: он боролся против традиционной для закрытых учебных заведений травли новичков и добился отмены этой «традиции». Спортом он не увлекался, но, по совету учителей, начал заниматься регби, чтобы его не считали трусом, и даже стал капитаном команды.
Затем Питер Митчелл окончил Кембриджский университет, где приобрел репутацию оригинала. Он играл на скрипке, вдобавок самоучкой освоил пианино, компании коллег-ученых предпочитал артистов. Задолго до появления первых хиппи ходил с длинными волосами, в одежде ярких цветов, шокируя респектабельную университетскую публику.
В Кембридже Митчелл специализировался по биохимии и после окончания университета остался работать на соответствующей кафедре. В 1951 году получил докторскую степень за исследование механизма действия модного нового лекарства — пенициллина, после чего занялся изучением механизма синтеза АТФ в клетках.
В 1955 году Питера Митчелла пригласили работать на кафедру зоологии Эдинбургского университета, где он проводил исследования в области биохимии и читал лекции студентам. Однако тяжелая болезнь — язва желудка заставила исследователя прервать академическую карьеру и выйти в отставку. С 1963 года он нигде не служил.
В 1961 году Митчелл и его жена приобрели небольшое поместье Глинн-Хаус — ферму и практически разрушенный дом в графстве Корнуолл, на юго-западе Англии. Митчелл занялся восстановлением дома. Вот как эту историю описывает российский коллега Митчелла Владимир Петрович Скулачев в книге «Рассказы о биоэнергетике».
«Были приглашены архитектор и бригадир строителей, с которыми Митчелл немедленно рассорился. Других в Бодмине достать было непросто, и хозяин решил сам взяться за постройку. Он нанял двух каменщиков.
— Чудесные простые люди, — рассказывал мне Митчелл, — жаль только, что один из них совершенно неожиданно оказался беглым каторжником, осужденным за убийство!
Когда полиция заинтересовалась одним из новых его коллег, Митчеллу пришлось сколачивать другую артель. Эта задача была не без труда решена, и на склоне холма у живописной речки Фой стали помаленьку вырисовываться очертания двухэтажного дома с дорическими колоннами вдоль фасада».
Митчелл освоился в Корнуолле, даже завел двух осликов, которых запрягал в коляску, возившую его детей в школу. Сельский труд благотворно сказался на его здоровье, и он вернулся к научным исследованиям. Глинн-Хаус стал не только его домом, но и маленьким частным институтом. Именно там он вместе со своей сотрудницей Дженнифер Мойл (1921–2016) выполнил исследования, отмеченные Нобелевской премией.
Клеточная электростанция
К середине 1950-х годов стали ясными многие свойства окислительного фосфорилирования. Оказалось, что окисление УОВ · H₂ происходит в несколько этапов. Кислород не напрямую взаимодействует с универсальным окислителем-восстановителем, между ними находятся несколько промежуточных окислителей-восстановителей. Эта последовательность окислительно-восстановительных реакций и набор ферментов, ее обеспечивающих, получили название дыхательной цепи, цепи переноса электронов или цепи окислительного фосфорилирования.
Стало также ясным, что окислительное фосфорилирование может происходить только на мембранах. У эукариот — на мембранах митохондрий, у бактерий — на внешних мембранах. В растворе реакции окислительного фосфорилирования не идут.
Первую концепцию, пытающуюся объяснить механизм синтеза АТФ при дыхании, предложил в 1953 году австралийский биохимик Эдвард Слейтер. Он считал, что при дыхании образуется какое-то нестойкое, богатое энергией соединение, при распаде которого и образуется АТФ. Подобная точка зрения получила название «химической концепции». Однако все попытки обнаружить таинственное соединение кончались неудачей. Это обстоятельство привело к появлению «конформационной концепции», согласно которой энергия, выделяющаяся при дыхании, деформирует белковые молекулы, а затем за счет энергии деформации синтезируется АТФ.
В любом случае оставалось непонятным, почему окислительное фосфорилирование никому не удалось наблюдать в растворе тех же самых белков, не связанных с мембранами.
В 1962 году выдающийся электронный микроскопист Умберто Фернандес-Моран — венесуэлец, эмигрировавший в США после очередной смены власти на его родине, — обнаружил на внутренней мембране митохондрий грибовидные частицы, торчащие шляпками в межмембранное пространство. (Мы помним, что у митохондрии две мембраны, это как бы мешочек в мешочке.) Вскоре американский биохимик Эфраим Рэкер отделил эти частицы от мембраны и получил их в чистом виде. При этом митохондрии потеряли способность синтезировать АТФ, хотя все дыхательные ферменты оставались в них. После добавления грибовидных частиц к мембранам способность фосфорилировать АДФ восстанавливалась, значит, именно эти структуры отвечают за синтез АТФ. Однако сами по себе грибовидные частицы, отделенные от мембран, не были способны ни к поглощению кислорода, ни к фосфорилированию.
В 1961 году, еще до открытия грибовидных частиц, Питер Митчелл опубликовал статью в «Nature», где предложил гипотезу, объясняющую, почему окислительное фосфорилирование в растворе невозможно. Причина в том, что синтез АТФ при окислительном фосфорилировании происходит за счет энергии, которая выделяется при переносе протона H⁺ через внутреннюю мембрану митохондрии, из межмембранного пространства во внутреннюю часть — матрикс. Мембрана с наружной стороны заряжена положительно, потому что межмембранное пространство богато ионами водорода (проще говоря, закислено), а с внутренней стороны — отрицательно. АТФ синтезируется за счет электрической, а не химической энергии! А роль цепи окислительного фосфорилирования заключается в том, чтобы пополнять запасы протонов на внешней стороне мембраны и поддерживать разность электрических потенциалов по обе ее стороны.
Электрическое поле в мембране очень сильное. Казалось бы, разность потенциалов по обе стороны мембраны небольшая. Но мембрана очень тонкая, поэтому напряженность поля (сила, действующая на электрический заряд) составляет миллионы вольт на метр!
Гипотеза Митчелла далеко не сразу нашла сторонников. Ее игнорировали, принимали в штыки, считали сумасшедшей или объявляли неоригинальной. Уже упоминавшийся Эфраим Рэкер, один из лидеров биоэнергетики, позже писал о статье Митчелла: «На фоне тогдашних умонастроений научного сообщества эти формулировки звучали как высказывания придворного шута или безумного пророка». Немалую роль в отторжении идей Митчелла сыграл и экстравагантный стиль его поведения. Есть основания предполагать, что переживания, связанные с неприятием его идей, и агрессивные дискуссии с коллегами способствовали обострению болезни и уходу Митчелла из официальной науки.
Между тем модель, предложенная Митчеллом, объясняла многие факты. В частности, почему для получения энергии необходима мембрана, причем целостная, неповрежденная. Уже была известна загадочная группа веществ под названием «разобщители окислительного фосфорилирования»: при их воздействии на митохондрии дыхание в них продолжалось, но молекулы АТФ не синтезировались. Топливо горит, но вал электрогенератора не вращается… В рамках гипотезы Митчелла естественно было предположить, что все эти вещества нацелены на мембрану. Возможно, они делают в ней дырки или каким-то иным способом увеличивают ее проницаемость для ионов, и в результате протоны возвращаются в матрикс митохондрии, не совершая полезной работы, то есть не обеспечивая синтез АТФ.
Как проверяли гипотезу Митчелла
Если Митчелл прав, то при дыхании на мембранах должна возникать разность потенциалов: снаружи плюс, внутри минус. Вставить электроды в бактерию или митохондрию в середине ХХ века было невозможно: они слишком маленькие. Но можно использовать косвенный метод: посмотреть, как будут проходить внутрь бактерий или митохондрий растворимые в мембранах ионы.
В 1964 году Сирил Мур и Бертон Прессман из Университета Пенсильвании показали, что добавление валиномицина, избирательно увеличивающего проницаемость мембран для катиона калия, приводит к тому, что этот катион начинает активно поступать в митохондрии, где его и без того достаточно. Этот эффект позже объяснили тем, что внутренняя сторона мембраны заряжена отрицательно, а наружная — положительно. Кстати, антибиотик валиномицин как раз относился к разобщителям.
К такому же выводу приводили и эксперименты советского биохимика и физиолога Ефима Арсентьевича Либермана (1925–2011). Он исследовал распределение синтетических катионов и анионов, легко проходящих через мембрану, и показал, что при включении дыхания катионы идут в митохондрии, а анионы — из митохондрий.
В дальнейшем этим же методом было показано существование разности потенциалов на мембранах бактерий и хлоропластов.
Валиномицин транспортирует через мембрану калий, но есть и другой возможный механизм действия разобщителей — увеличение проницаемости мембран для катионов водорода. И это предположение экспериментально подтвердилось. Добавление разобщителей вызывало быструю диффузию через искусственные мембраны.
Далее гипотеза Митчелла предполагала, что механизм воздействия, по крайней мере, некоторых разобщителей поглощения кислорода и фосфорилирования связан с увеличением электропроводности мембраны. Ведь мембрана с высокой проводимостью не сможет поддерживать разность потенциалов. В 1966 году Альберт Ленинджер подтвердил, что добавление разобщителя динитрофенола увеличивает проводимость искусственной фосфолипидной мембраны, а Е.А. Либерман в том же году продемонстрировал аналогичные свойства тетрахлортрифторметилбензимидазола (ТТФМ).
Еще одно предсказание: интенсивное дыхание плотной взвеси бактерий и митохондрий будет сопровождаться закислением внешней среды, так как протоны будут выкачиваться наружу. Это предположение экспериментально подтвердил сам Митчелл. И здесь возник некоторый конфуз, который поставил под сомнение его концепцию.
Митчелл обнаружил закисление и доложил об этом на конференции. А присутствовавший на заседании Бриттон Чанс, еще один лидер мировой биоэнергетики, сказал, что он тоже наблюдал подобное явления. Механизм этого явления оставался для Чанса неясен, но он явно не такой, как предполагает Митчелл, поскольку добавление веществ, связывающих двухвалентные катионы, снимало эффект.
Митчелл повторил опыты Чанса и убедился в его правоте. Более того, добавление дополнительных количеств ионов кальция эффект восстанавливало.
Тогда Митчелл более аккуратно рассчитал возможное изменение рН и убедился, что оно значительно меньше, чем он предполагал вначале, и находится на грани чувствительности его самодельного рН-метра. Дело в том, что с выходом протонов наружная сторона мембраны заряжается положительно, а это тормозит выход катионов наружу.
Но почему же тогда в его экспериментах наблюдалось закисление? И почему это закисление снималось катионами кальция? Митчелл нашел простое объяснение. И в цитоплазме, и во внутреннем пространстве митохондрий кальция очень мало. А в искусственной среде, где Митчелл (и Чанс) держали митохондрии, его значительно больше. Поэтому кальций идет через мембрану внутрь, и мембрана разряжается, что позволяет катионам водорода свободно выходить наружу. Отсюда-то и появляется наблюдавшееся в опыте значительное закисление внешней среды. Так опровержение гипотезы превратилось в ее подтверждение.
Гипотеза также предсказывала, что избыток катионов водорода по нужную сторону мембраны приведет к кратковременному включению синтеза АТФ даже при отсутствии внешнего источника энергии. Эта идея легла в основу экспериментов Эндрю Ягендорфа из Корнеллского университета и его сотрудника Эрнеста Юрайба, выполненных в 1965 году.
Ягендорф и Юрайб были физиологами растений и работали не с митохондриями, а с хлоропластами — клеточными органеллами, осуществляющими фотосинтез. Сначала они выдерживали хлоропласты длительное время в кислой среде в отсутствие света, при этом рН внутри и вне частиц выравнивалась. После этого в раствор добавляли щелочь, и в результате без освещения синтезировалось некоторое количество АТФ.
С первого взгляда кажется, что эксперименты Ягендорфа и Юрайба не подтвердили, а опровергли концепцию Митчелла. Но все становится на свои места, если предположить, что на мембране хлоропластов плюс и минус поменялись местами. Наружная сторона мембран оказалась заряженной отрицательно, а внутренняя — положительно, и синтез АТФ происходит не при входе протонов в частицы, а при их выходе. Эта идея полностью подтвердилась.
Вначале Ягендорф, как и многие другие, отрицательно относился к идеям Митчелла. Но после проведения своих экспериментов изменил свои взгляды и стал активным сторонником новой концепции.
Еще один красивый опыт провел Бертон Прессман. Он держал митохондрии в среде, богатой калием, а затем переносил их в среду без калия и добавлял валиномицин, увеличивающий проводимость мембран для этого аниона. В результате при отсутствии поглощения кислорода начинался синтез АТФ. Объяснение здесь простое: калий выходил из митохондрий, в результате чего на мембране возникала разность потенциалов.
Победа и признание
В 1970-х годах концепция Митчелла, получившая название «хемиосмотической теории», стала получать все больше и больше подтверждений. И вчерашние противники один за другим переходили на его сторону.
«Митчелл воспринял приятную для себя весть [о работах Либермана и других советских ученых, занимавшихся проницаемостью мембран] по-своему. Он завел большую географическую карту мира и воткнул в Москву красный флажок, — вспоминает В.П. Скулачев. — Когда в 1975 году молодой сотрудник нашей лаборатории И. Козлов посетил Глинн-Хауз, он обнаружил, что карта усеяна красными флажками: так Митчелл отмечал места, откуда приходили вести о подтверждении хемиосмотической теории».
Подлинным триумфом Митчелла стала работа Джулиуса Адлера с соавторами, опубликованная в 1974 году. Они обнаружили мутантную бактерию, способную поглощать кислород, но неспособную синтезировать АТФ при дыхании. Оказалось, что такой мутант сохраняет способность к движению с помощью жгутиков, которое активизируется в присутствии значительных количеств кислорода. Бактерия дышит, АТФ не синтезируется, но бактерия продолжает двигаться. Последующие опыты показали, что этот эффект исчезает при добавлении веществ, которые могут переносить катионы водорода через мембрану. Логично предположить, что источником энергии, приводившей в движение жгутики, была разность потенциалов на мембране, использованная напрямую, а не через АТФ. Эту гипотезу проверил в 1978 году аспирант Скулачева Алексей Николаевич Глаголев. Он заблокировал дыхание бактерий (после чего движение, естественно, прекратилось), а затем добавил кислоту. И бактерии снова начали двигаться!
Нобелевскую премию по химии Питер Митчелл получил в том же 1978 году. В своей нобелевской лекции он с удовлетворением отметил, что история хемиосмотической теории опровергла идею Макса Планка о том, что новые теории принимаются научной общественностью только после вымирания сторонников старых теорий. Это, по мнению Митчелла, свидетельствует о росте благородства научного сообщества.
Работы Митчелла показали, что в природе функционируют не один, а два последовательных аккумулятора энергии. Первый — это мембрана, по разные стороны которой существует разность электрических потенциалов и концентрации катионов. Второй аккумулятор — молекулы АТФ. Энергия, выделяющаяся при сжигании «топлива», идет на зарядку первого аккумулятора, а затем за счет энергии, запасенной в первом аккумуляторе, заряжается второй аккумулятор. В некоторых случаях (как с бактерией Адлера) для выполнения работы используется энергия, запасенная не во втором, а в первом аккумуляторе, — подобно тому, как энергия воды может использоваться для производства электроэнергии, но может и просто вращать мельничное колесо.
Ферментный комплекс, обеспечивающий синтез АТФ при прохождении протона вдоль электрического поля через мембрану, — та самая грибовидная частица, о которой мы говорили в начале, — получил название АТФ-синтазы. Очень существенно, что она может работать в двух направлениях: не только синтезировать АТФ при прохождении протонов внутрь, но и выкачивать протоны наружу с затратой АТФ. Это наводит на мысль о том, что АТФ-синтазная система изначально формировалась, как механизм энергозависимой регуляции рН древних клеточных организмов, и лишь затем стала работать в обратном направлении, обеспечивая синтез АТФ.
Механизм работы АТФ-синтазы выяснил Пол Бойер (1918–2018). А ее строение методом рентгеноструктурного анализа установил Джон Уокер (р. 1941). В 1997 году их работы также были отмечены Нобелевской премией по химии.
Следует отметить, что в том же 1961 году идеи, близкие к идеям Митчелла, высказал в своей статье американец Роджер Уильямс (1893–1988), более известный исследованиями витаминов. Однако он предполагал существование надмолекулярных комплексов, включающих как белки, обеспечивающие транспорт электрона через мембрану, так и белки, обеспечивающие синтез АТФ. Модель Митчелла не нуждалась в таком предположении: по его представлениям, дыхание и синтез АТФ не были столь жестко сопряжены друг с другом.
Несмотря на слабое здоровье и большую загруженность научной работой, Питер Митчелл был общественно активным человеком. Он участвовал в природоохранном движении и в движении за сохранение исторических памятников. Эксцентричный артист, каким он был в молодости, не исчез, но артистизм принял иную форму. Нобелиат из Глинн-Хауза не поддерживал централизацию науки, полагая, что переизбыток планирования убивает творческое начало исследования. «Мы занимаемся наукой не потому, что мы ученые, а из-за науки — мы делаем это, потому что мы люди, — говорил он. — Это чудеснейшее романтическое и культурное занятие, не менее чудесное, чем работа скульптора». Как отмечал В.П. Скулачев, биография Питера Митчелла наглядно показывает, что время одиночек в науке не закончилось. Пусть «науку делают большие батальоны», но идея приходит в одну голову.
Питер Митчелл умер 10 апреля 1992 года в возрасте 71 года. В сравнении со многими другими героями этой статьи, такими как Пол Бойер (1918–2018), Эдвард Слейтер (1917–2016), Бриттон Чанс (1913–2010), Эндрю Ягендорф (1926–2017), Митчелл прожил недолгую жизнь. Но эта жизнь была яркой и насыщенной. Митчелл обладал бойцовскими качествами, без колебаний шел против течения. В том числе благодаря этому он еще при жизни стал классиком науки, подобно первооткрывателям строения ДНК Джеймсу Уотсону и Фрэнсису Крику. Строго говоря, его вклад в биологию не менее важен.
Кандидат биологических наук
С.В. Багоцкий
Купить номер или оформить подписку на «Химию и жизнь»: https://hij.ru/kiosk2024/
Благодарим за ваши «лайки», комментарии и подписку на наш канал
– Редакция «Химии и жизни»