Мы продолжаем серию публикаций про теорию хроматографии и сегодня узнаем, как же происходит испарение пробы в испарителе, поехали.
Так что же происходит при попадании образца в испаритель?
Перенос пробы в капиллярную колонку
От того, насколько хорошо работает система ввода, напрямую зависит результат исследования.
Разработаны и используются различные варианты ввода пробы, так как на процесс разделения влияет ряд параметров: диаметр колонки, неподвижная фаза, ее толщина, ёмкость, тип и скорость газа-носителя. Кроме того, хроматографические методы позволяют разделять вещества с разной летучестью в широком диапазоне концентраций.
Результатом хроматографического анализа точное отображение реального состава исследуемой пробы. Возможные ошибки могут появляться из-за сочетания нескольких факторов: некорректного введения образца, особенностей колонки и детектора. Часто при анализе наблюдается "дискриминационный" эффект, т.е. не происходит перенос всех составляющих пробы в систему. Также в некоторых случаях аналиты способны сорбироваться (обратимо или необратимо) и разрушаться внутри колонки.
Основной критерий, который необходимо соблюдать работе — точное соответствие состава образца, вводимого в систему, исходному составу.
В хроматографической практике наиболее широко применяются четыре основных способа инжекции пробы:
· С делением потока (Split Injection): Большая часть пробы после испарения направляется в систему сброса, а в колонку поступает лишь небольшая, точно дозируемая ее часть. Метод применяется для концентрированных образцов.
· Без деления потока (Splitless Injection): Вся испарившаяся проба переходит в колонку. Этот способ предназначен для анализа следовых количеств целевых компонентов.
· Прямой ввод в колонку (On-column Injection): Жидкая проба вводится напрямую в хроматографическую колонку, минуя испаритель, что исключает термическую деградацию и обеспечивает анализ термолабильных соединений.
· Ввод с программированием температуры испарителя (PTV Injection): Проба вводится в холодный испаритель, после чего его температура резко повышается для контролируемого испарения аналитов. Данный метод универсален и позволяет работать с широким диапазоном проб.
Для эффективного разделения необходимо вводить пробу узкой хроматографической зоной. Для этого применяются разные приемы:
· Малые объемы (до 5 нанолитров). Это возможно реализовать разделением потока при помощи специальных устройств. Испаренный образец в смеси делится на потоки с отличающимися объемными скоростями.
· Метод on-column ввода предполагает прямое попадание пробы в хроматографическую колонку без предварительного формирования узкой зоны. Чтобы скомпенсировать это, проводится этап фокусирования, который концентрирует аналиты в начале колонки. Это достигается либо за счет термического эффекта от растворителя, либо за счет удерживающей способности неподвижной фазы самой колонки.
Ввод пробы с делением потока
Первый реализованный и самый распространенный прием в капиллярной газовой хроматографии. Раствор образца, введенный шприцем переходит в газообразную фазу в лайнере испарителя. Для разделения используется лишь небольшая часть испаренной пробы. Большая часть испаренного образца сбрасывается. Этот прием позволяет избежать перегрузки капиллярной колонки и детектора.
В испарителе поток газa-носителя разделяется. Одна его часть предназначена для продувки септы (septum purge), предотвращая ее деградацию и загрязнение системы. Основной поток поступает в лайнер — стеклянную или кварцевую вставку, где жидкая проба мгновенно испаряется и тщательно перемешивается с газом-носителем. На выходе из испарителя происходит второе разделение потока, и лишь небольшая его часть (содержащая аналиты) направляется непосредственно в хроматографическую колонку для разделения, в то время как избыток выводится через систему сброса.
Выбор коэффициента деления потока (split ratio) зависит от диаметра капиллярной колонки и решаемой аналитической задачи. Для колонок с внутренним диаметром 0.22–0.32 мм стандартным является диапазон 1:50 – 1:400. Более низкие соотношения (1:5 – 1:50) применяются при работе с колонками большего диаметра, обладающими повышенной ёмкостью, или в методах, требующих фокусирования пробы в начале колонки (например, splitless-инжекция).
Главная проблема при таком вводе — это дискриминация (искажение состава образца). Дискриминация появляется при мгновенном испарении, при котором компоненты могут вести себя по-разному. Это особенно заметно при наличии компонентов с разной летучестью, полярностью и концентрацией. Дискриминация пробы зависит как от самого прибора, так и от способа ввода, например, от техники работы с инструментом. Идеальное разделение — когда соотношение остается строго заданным и не меняется, что на практике почти недостижимо, если смесь сложная.
Нелинейность деления потока является примером системной дискриминации, вызванной особенностями устройства ввода пробы. Под линейностью понимается строгое соответствие реального коэффициента сброса потока установленному значению, причем этот коэффициент одинаков для всех компонентов смеси. Однако достижение такой линейности невозможно, если в пробе присутствуют вещества с различной летучестью, полярностью или широким диапазоном концентраций. Эта нелинейность проявляется даже в том случае, если сам процесс ввода пробы в испаритель (лайнер) был выполнен без дискриминации.
К нелинейности деления потока приводят три основные причины: разная диффузия аналитов, их неполное испарение и нестабильность коэффициента деления.
Чтобы снизить искажения, необходимо добиться полного испарения пробы и ее равномерного перемешивания с газом-носителем до попадания в колонку. Проблема в том, что введенная проба изначально неоднородна — это смесь паров и капель жидкости. Для решения этой задачи применяют более высокие температуры и специальную конструкцию лайнера, способствующую испарению и смешиванию.
Однако основная причина искажений — это эффекты, которые возникают из-за иглы шприца. Когда игла проходит через нагретый испаритель, летучие вещества начинают испаряться прямо внутри нее. После нажатия на поршень легкие составляющие испаряются быстро, а менее летучие могут остаться внутри иглы. Когда иглу извлекают, эти не успевшие испариться соединения не попадают в испаритель, что искажает компонентный состав пробы. Это хорошо видно при анализе алканов.
Качество шприца тоже сильно сказывается на результате. Со временем шприц изнашивается: нарушается целостность, стирается поршень, что ведет к невозможности его эксплуатации.
Иллюстрация дискриминации на примере предельных углеводородов. В сравнении прямым вводом холодной иглой в колонку, при инжекции заполненной или горячей иглой концентрации тяжелых углеводородов искажаются, наиболее сильно в первом случае.
Нагрев иглы - одна из главных причин дискриминации пробы.
Для уменьшения эффекта нагрева иглы следует:
· вводить пробу моментально;
· применять предварительно охлажденную иглу;
· программировать температуру испарителя.
Использование автоматического дозатора является оптимальным методом обеспечения высокой воспроизводимости ввода пробы. Механизм дозатора гарантирует идентичное выполнение всех стадий процесса с высокой скоростью, что предотвращает нежелательный нагрев иглы — условие, практически недостижимое при ручном вводе. Благодаря высокой скорости инжекции, компоненты пробы не успевают испариться внутри канала иглы, что обеспечивает полную и точную передачу заданного объема в колонку. Температура испарителя подбирается достаточно высокой для быстрого испарения пробы, но не настолько высокой, чтобы компоненты разложились. Часто оптимальную температуру подбирают экспериментально, измеряя сигнал детектора при разных значениях. Обычно начинают с температуры 250 C или с той, которая рекомендована в источнике.
Советы по вводу пробы:
· Всегда вводите одинаковое количество вещества (как правило 0,5-2,0 мкл).
· Температуру испарителя настраивайте под свою цель. Не используйте слишком высоких значений.
· Если вы вводите пробу вручную, предпочтительнее использовать быстрый вкол горячей иглой.
· Старайтесь не использовать легколетучие растворители.
· Трудности, возникающие из-за работы с ручным вводом шприца, можно решить с помощью автоматического дозатора.
Возникли проблемы с воспроизводимостью результатов? Не можете подобрать режим? Мы всегда готовы помочь! Наши инженеры найдут источник затруднений, оптимизируют настройки ввода проб и оснастят вашу лабораторию современными автоматическими дозаторами.
Подписывайтесь, чтобы не пропустить продолжение! В следующих статьях мы разберем все остальные этапы хроматографического процесса — от колонки до детектора.