Сергей Сергеевич Тарасов, старший преподаватель кафедры ботаники, физиологии и защиты растений Нижегородского ГАТУ
Методический аппарат лежит в основе любой науки. Он необходим для получения объективных и достоверных данных, обсуждая и интерпретируя которые ученые делают выводы, на основе чего строятся научные теории и концепции.
Генетика, являясь биологической наукой со своими объектами, целями и методами, фактически служит фундаментальным связующим звеном для всей биологии и смежных наук (медицина, психология, ветеринария, сельскохозяйственные науки и ряд других). Она описывает и изучает структуру и функционирование генетического аппарата, его происхождение, развитие и изменение.
Используемые генетические методы можно разделить на 3 группы: классические, молекулярно-генетические и биоинформатические.
Классические методы (в том числе метод гибридологического анализа, генеалогический, близнецовый, онтогенетический, популяционно-статистический и ряд др.) оценивают особенности наследования признаков по их фенотипическому проявлению. Фактически они существуют со времён Г.И. Менделя и появились в момент зарождения самой генетики. Несмотря на почтенный возраст, они не утратили свою актуальность и по сей день используются во многих исследованиях. Ключевым недостатком данных методов является отсутствие у них геноспецифичности, т.е. главный измеряемый параметр – это фенотипический признак (внешние особенности – цвет, форма, размер и пр., внутренние – строение, физиологические характеристики (например, скорость бега у животных или интенсивность фотосинтеза у растений) и даже биохимические показатели (например, активность фермента, количество какого-либо вещества в тканях и т.д.)), ассоциируемый с неким геном(ми), который(ые) невозможно идентифицировать без применения молекулярных методов.
Молекулярные методы исследования. Они имеют большое значение в развитии современной науки. К ним, в частности, можно отнести: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), рестрикцию, легирование, электрофорез, иммуноферментный анализ, секвенирование и ряд других. С их помощью можно более подробно и точно изучать генетический аппарат, использовать в биоинженерии, сельском хозяйстве, медицине, и т.д. Ниже будут рассмотрены методы: ПЦР, рестрикция, легирование и секвенирование.
Наиболее распространённым методом является ПЦР. Благодаря ему можно быстро наработать определённый фрагмент ДНК в пробирке с использованием ДНК-матрицы, выделенной из живых организмов или их остатков, тем самым выявить ее наличие или отсутствие, а также установить исходное количество молекул. Сам по себе метод ПЦР не является самостоятельным и тесно связан с другими методиками, а именно: выделение ДНК или РНК из клеток или другого субстрата, проведение обратной транскрипции, т.е. синтез кДНК (если изначально была выделена РНК), визуализация продуктов ПЦР с помощью электрофореза или фотометрии. Разберём суть метода немного подробнее. Итак, для того чтобы провести данную реакцию, необходимы определённые компоненты, а именно ДНК-матрица, фермент ДНК-полимераза, который и осуществляет синтез новых цепей ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, из которых строится новая цепь ДНК, специальный буферный раствор, который создает нормальные условия для работы фермента, ионы магния, также необходимые для нормального функционирования фермента, и пара праймеров (прямой и обратный) – это особые олигонуклеотиды, которые комплементарны определённым участкам ДНК-матрицы, необходимы для связывания ДНК-полимеразы с цепочкой самой ДНК, а также для идентификации самой молекулы ДНК, т.к. они связываются строго комплементарно. Если в среде нет комплементарных участков для праймера, то ПЦР не пройдет, а значит, нужной ДНК в среде нет. Кроме реактивов, нужны также определённые приборы и расходные материалы: автоматические дозаторы, позволяющие точно добавить компоненты, пробирки типа эппендорф, планшеты для пробирок, сменные чистые носики для дозаторов и амплификатор – прибор, который создает условия для прохождения ПЦР, резко меняя температуру в течение нескольких секунд. Стоит также отметить, что для выделения ДНК/РНК требуются дополнительные приборы, в том числе центрифуги, морозильные шкафы, настольный термостат и ряд других. После приготовления ПЦР-смеси необходимо запустить саму реакцию. Для этого необходимо поместить пробирки в амплификатор и задать протокол процедуры, включающий следующие этапы:
- первичная денатурация ДНК (однократно), температура 95-98 градусов, длится несколько минут в зависимости от длины ДНК-матрицы, вторичная денатурация ДНК длительностью 20-60 секунд при аналогичных условиях, данные этапы необходимы для того, чтобы раскрутить ДНК-матрицу на 2 цепи;
- отжиг праймеров, т.е. прикрепление олигонуклеотидов к раскрученным цепям ДНК за счёт образования комплементарных водородных связей между молекулой ДНК и праймером, к которому прикрепляется ДНК-полимераза, обычно он длится 15-30 сек при температуре 50-70 С;
- элонгация, т.е. синтез фрагментов дочерних молекул ДНК, заданных прямым и обратным праймером, длительность зависит от длины синтезируемого фрагмента, примерно 1 секунду на 10 нуклеотидов, если синтезируемый фрагмент имеет длину 500 нуклеотидов, время элонгации должно быть равным примерно 50 сек, протекает при 68-72 С. Вторичная денатурация, отжиг праймеров и элонгация повторяются многократно, количество циклов зависит от условий эксперимента и обычно составляет от 25 до 40 циклов.
- по окончании циклов необходима финальная достройка цепей ДНК, обычно она длится несколько минут, после наступает стадия хранения при минимальной температуре, длится неопределённый срок. Хранение – необязательный этап, а его применение необходимо в случае дальнейшего использования ПЦР-продукта при условии невозможности доступа в лабораторию по окончании ПЦР.
Данный метод используется для выявления ДНК организмов в науке, судебно-медицинской и санитарной экспертизе, медицинской диагностике, фитопатологии и т.д. Например, с помощью ПЦР можно диагностировать инфекционные болезни, выявлять наличие определенных компонентов в продуктах питания, определять родство между людьми и т.д.
Рестрикция ДНК/РНК – это метод, основанный на работе ферментов эндорестриктаз, которые расщепляют молекулы нуклеиновых кислот (НК) в области строго специальной последовательности – сайт рестрикции, например, рестриктаза BamHI, разрезает ДНК при наличии в ней последовательности 5’- G G A T C C -3’, а если в ДНК отсутствует данная последовательность, эта рестриктаза не способна повредить молекулу. В природе рестриктазы участвуют в естественном процессе распада нуклеиновых кислот, а также являются основой клеточного иммунитета при проникновении в них чужеродных НК (например вирусов). Такое избирательное действие позволяет применять рестриктазы для исследований ДНК. Комбинации с различными рестриктазами позволяют получать уникальную смесь, состоящую из ДНК с разной длиной. Последующая визуализация дает уникальную картинку, своеобразный штрих-код, который является высокоспецифичным и позволяет устанавливать связь между ДНК и видом или даже конкретной особью. Механизм рестрикции также используют в биотехнологиях для создания генетических конструкций, позволяющих сделать разрез в строго заданном месте. Например, при создании генетических векторов для получения генномодифицированных организмов (ГМО), вакцин или геннотерапевтических лекарств.
Легирование – метод, основанный на способности фермента лигазы сшивать фрагменты НК, в природе этот механизм лежит в основе репликации и репарации ДНК. В биотехнологии лигирование наравне с рестрикцией используется для создания генетических конструкций.
Секвенирование – это группа методов расшифровки нуклеотидных последовательностей в НК или аминокислотных последовательностей в белках. Наиболее распространенными, удобными и точными являются методы секвенирования ДНК. Именно благодаря секвенированию был реализован проект генома человека, возможно выявление новых штаммов болезнетворных микроорганизмов у человека и животных, установление вариативности генов, лежащих в основе генетического разнообразия особей, в том числе человека. Благодаря внедрению секвенирования можно гораздо эффективнее диагностировать и лечить многие заболевания, выявлять новые микроорганизмы, быстрее выводить сорта растений и породы животных и т.д. Принцип секвенирования зависит от применяемого метода, так выделяют такие способы, как: секвенирование по Сенгеру, иллюмина, пиросеквенирование, нанопоровое секвенирование и др.
Интересно отметить, что с помощью молекулярных методов удалось выяснить природу генов, отвечающих за зеленый и желтый цвет и морщинистую и гладкую форму горошин, которые в своих исследованиях описывал Г.И. Мендель, что привело к формулированию его законов (закон единообразия гибридов первого поколения, закон расщепления у гибридов второго поколения и закон независимого наследования признаков). Так, было выявлено, что зеленый цвет у горошин связан с мутацией гена, кодирующего фермент хлорофиллазу. Этот фермент участвует в процессе распада хлорофилла при созревании гороха. Поэтому при условии, что в генотипе оба гена мутантные, синтезируется «сломанный» фермент, который не может выполнять свои функции, что препятствует распаду хлорофилла, поэтому горошины остаются зелеными. Другой признак – форма горошин связана с мутацией генов, кодирующих фермент SBEI (starch-branching enzyme), отвечающий за удлинение крахмальной цепи, именно он соединяет глюкозу и образует крахмал, который накапливается в семенах. Мутантный ген кодирует более слабый фермент, что приводит к снижению синтеза крахмала. Поэтому при созревании у недозаполненных крахмалом семян их оболочка начинает сморщиваться.
Биоинформатические методы – это особый инструмент, без которого невозможно развитие современной науки персонализированной медицины и селекции. Благодаря биоинформатике стали возможными хранение, систематизация, обработка и использование гигантских объёмов генетической информации, которая с каждым годов увеличивается все быстрее. В литературе описывается множество различных биоинформатических инструментов, в т.ч. базы данных, программы обработки генетической информации, программы создания генетических конструкций и пр. При этом постоянно создаются и внедряются новые наработки, которые обеспечивают интеграцию между базами данных и программами, помогают предсказывать новые свойства молекулам, создавать генетические конструкции.
Разберем некоторые наиболее распространенные инструменты биоинформатики.
Генетическая база данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) - наиболее ёмкая генетическая база, в которую стекается огромное количество данных, посвящённых нуклеотидным и аминокислотным последовательностям, генам, геномам и т.д. По сути, это платформа, на базе которой созданы отдельные базы или инструменты. Например, геномная база данных (рис. 1).
Множественное и попарное выравнивание последовательностей, например с применением программы MEGA-X (https://www.megasoftware.net/), позволяет сравнить последовательности, выявляя в них как консервативные (одинаковые участки), так и вариативные (отличающиеся фрагменты) (рис. 2).
Филогенетические связи и создание дендрограмм (https://www.megasoftware.net/) позволяет понять, насколько последовательности похожи друг на друга. Данный подход лежит в основе современной систематики и филогении (рис. 3).
Программы подбора праймеров, например Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast), дают возможность подобрать праймеры для ПЦР и планировать молекулярно-генетическую работу.
Сервис Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) является инструментом поиска похожих записей по заданной последовательности:
- выявление сайт-связывающих доменов и в молекулах белков, например Scan-Protsite (https://prosite.expasy.org/scanprosite/), и моделирование белковых структур, например Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/), дает возможность предугадать функциональность белков;
- поиск сайтов связывания в НК позволяет выявлять участки ДНК/РНК, которые взаимодействуют с регуляторными белками и контролируют процессы реализации генетической информации;
- программы создания генетических конструкций, например Ugen (https://ugene.net/ru/download.html), позволяет проводить их моделирование, что даёт возможность конструировать генетические векторы и создавать новые биообъекты в лаборатории.
Генетические методы имеют большое значение как в развитии науки, так и в хозяйственной деятельности человека, а применение их в образовательном процессе позволяет по-новому взглянуть на живую природу, понять основы мироздания, развивать критическое мышление и навыки проектной работы, которые позволят будущим специалистам эффективно осуществлять научные исследования, лечить людей и животных, выращивать растения, создавать новые лекарства, средства защиты растений, пищевые препараты, выводить сорта растений и породы животных и т.д.
При грантовой поддержке Минобрнауки России в рамках Десятилетия науки и технологий