Всем доброго дня и хорошего настроения) В этой статье мы поговорим о не менее важной теме, которую постоянно спрашивали у меня на парах. Она была довольно скучная для меня, но всегда актуальна особенно в государственных и частных лабораториях.
Немного расскажу о культивировании микроорганизмов, принципы посева и все что связано с этой тематикой.
Культивирование микроорганизмов и особенности их культуральных свойств
Для изучения свойств микроорганизмов и получения биомассы в лабораторных условиях используют их культивирование. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов. Микроорганизмы могут культивироваться на питательных средах, а некоторые только в живых организмах и клетках.
Питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необходимые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные микроорганизмы растут на простых питательных средах, другие для своего размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, витаминов.
По составу и происхождению питательные среды бывают естественные, искусственные и синтетические.
Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие овощи.
Искусственные питательные среды готовят по определенной прописи из продуктов с добавлением органических и неорганических соединений.
Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.
По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные.
В качестве уплотнителя обычно применяют агар - полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100ºС и застывающий при 45ºС. Для получения плотной питательной среды агар добавляют в концентрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%.
По целевому назначению питательные среды могут быть разделены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические.
Обычные (простые) питательные среды применяют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).
Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.
Никогда не забуду истории на лекции, как когда-то в виварии жил барашек, у которого брали кровь для создания кровяного агара.
Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.
Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других по их ферментативной активности к определенным веществам (углеводы, белки, редуцирующая способность).
Общие принципы посевов
О питательных средах немножко поговорили, теперь разберем общие принципы и механизм посева на питательные среды.
Для получения достоверных результатов, необходимо соблюдать ряд условий:
- условия транспортировки образцов в лабораторию;
- временной интервал от взятия биоматериала до посева;
- условия безопасности при работе с образцами;
- условия выбора сред для первичного посева в зависимости от типа образца и его анатомического происхождения;
- учитывать необходимость предварительной обработки перед инокуляцией (например, центрифугирование, гомогенизация, разведение);
- условия культивирования: температура инкубации и атмосфера.
Методы посева образцов
Метод секторных посевов (по Голду) - метод исследований в микробиологии, который позволяет определить степень обсеменённости и выделить возбудителя заболевания в чистой культуре.
1. Разделяем чашку Петри на четыре сектора;
2. Наносим клинический образец на поверхность среды. Материал на тампоне втираем в поверхность, поворачивая его круговыми движениями, на небольшом участке среды. При посеве пипеткой наносим на поверхность среды 1-2 капли жидкого материала;
3. Бактериологической петлей аккуратно распределяем образец штрихами по поверхности питательной среды на площади ¼ чашки, совершая возвратно-поступательные движения несколько раз, не заходя в область, на которую ранее был нанесен штрих;
4. Прожигаем петлю. Поворачиваем чашку на четверть оборота, проводим четыре перпендикулярных штриха из первого сектора во второй сектор, захватывая засеянную область;
5. Снова прожигаем и проводим четыре перпендикулярных штриха в
третий сектор;
6.Делаем тоже самое для четвертого сектора.
7. Закрываем крышку, инкубируем чашку при соответствующей температуре в
перевернутом положении, чтобы предотвратить образование конденсата.
Метод Линдсея - это метод посева в микробиологии, который используется для выделения чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий.
1. Петлей с биоматериалом наносим 30-40 штрихов на половину среды на чашке (сектор 1);
2. Прожигаем петлю, проводим ею по радиусу от края чашки к центру через засеянную половину среды, затем сделайте посев на 1/4 среды
(сектор 2);
3. Вновь прожигаем петлю, проводим ею по радиусу через посев второго сектора, затем делаем посев на оставшуюся незасеянную часть среды (сектор 3).
Метод истощающего штриха - метод выделения чистых культур микроорганизмов с помощью плотных питательных сред.
1. Бактериологической петлей с биоматериалом делаем зигзагообразный посев по поверхности агара на площади ¼ чашки (сектор 1), от наружной части к центру;
2. Не обжигая петлю, продолжаем посев штрихом по чашке в виде секторов (сектора 2,3,4), поворачивая чашку каждый раз на 90ºС.
Метод Дригальского - метод механического разделения микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри, чтобы получить изолированные колонии, из которых отсевом можно выделить чистую культуру микроорганизма.
Для данного метода обычно используют три чашки с плотной питательной средой. Вообще чашек можно и больше трех.
1. В первую чашку вносим одну каплю исследуемого материала, стерильным шпателем втираем его в поверхность питательной среды;
2. Не прожигая шпателя и не набирая нового материала, переносим шпатель во 2-ю, а затем в 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.
Интерпретация результатов
- В первой чашке наблюдается рост микробов в виде сплошного налёта.
- В последующих чашках содержание микроорганизмов снижается, и образуются изолированные колонии.
Несекторный метод посева - это способ распределения исследуемого материала (например, мочи) по поверхности питательной среды без разделения чашки Петри на секторы, тоже для получения изолированных колоний. С целью получения чистой культуры и подсчета колоний, выросших из разведений.
Процедуру осуществляют тарированной на определенный объем стерильной
бактериологической петлей или полуавтоматическим дозатором со сменным стерильными наконечникам.
1. На чашку Петри с питательной средой наносим строго определенный объем
исследуемого образца;
2. Распределяем материал по поверхности питательной среды несколькими
вертикальными, а затем перпендикулярными им горизонтальными штрихами, отстоящими друг от друга на небольшое расстояние;
3. Закрываем крышку и ждем 10-20 минут, затем инкубируем чашку в перевернутом положении при температуре 35-37°С в условиях обычной атмосферы 18-24 ч.;
4. По окончании инкубации производим подсчет колоний в секторах и сверяем их с табличными значениями.
Метод посева на селективные среды -это способ культивирования микроорганизмов на средах, которые обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов. С целью выделения чистой культуры микробов и дальнейшего изучения их свойств.
1. Тампоном или петлей делаем зигзагообразный посев на части поверхности агара (четверть или половину), стараясь избегать краёв чашки;
2. Закрываем крышку, инкубируем чашку при соответствующей температуре в
перевернутом положении, чтобы предотвратить образование конденсата.
Метод разведений-метод, основанный на последовательном разведении исследуемого материала или антибиотика, для того чтобы определить минимальную подавляющую концентрацию препарата, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
-Для метода разведений в жидкой питательной среде каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из неё каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8–10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, уменьшается.
-Для метода разведений в плотной среде готовят двойные серийные разведения препарата, затем вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки, содержащие по 4 мл (или 9 мл) охлаждённого до 45 °С агара. Процедуру проводят одной пипеткой с перенесением препарата от меньшей концентрации к большей. Содержимое пробирок можно быстро внести в чашки Петри или пробирки «скашивают» до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой стандартизированной тест-культурой и инкубируют 18–20 часов при 37 °С.
Схема условная, как пример, с целью понимания самой механики процесса.
Культивирование отдельных групп микроорганизмов
Методы культивирования анаэробов
Для культивирования анаэробов необходимо создать анаэробные условия путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.
Физические методы основаны на выращивании анаэробов в среде без воздуха.
1) Механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.
2) Выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.
3) Наиболее простой, но менее надежный способ - посев уколом в высокий столбик сахарного агара.
Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.
Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.
Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:
1) Посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци.
2) Посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци.
Культивирование микоплазм.
Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью - с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток.
Культивирование грибов.
Для культивирования грибов применяют плотные и жидкие питательные среды: чаще всего среду Сабуро, а также среды, содержащие пивное сусло. Грибы растут медленнее, чем бактерии, они образуют видимый рост в течение нескольких суток. Температура культивирования ниже, чем у бактерий - 22-30ºС.
Культивирование спирохет и простейших.
Среди спирохет наиболее легко выращивать лептоспиры, питательной средой для которых может служить вода с примесью сыворотки крови кролика. Боррелии и трепонемы культивируют в анаэробных условиях на более сложных питательных средах, содержащих сыворотку, кусочки тканей животных.
Среди простейших культивируются на питательных средах дизентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, балантидии.
Токсоплазмы культивируют в куриных эмбрионах и культурах тканей.
Риккетсии - облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных.
Этот раздел можно писать бесконечно долго, все больше и больше внося дополнительной литературы. Но все охватить нереально, да оно и не нужно. Учитывая, что наука не стоит на месте, существует достаточно более простых и быстрых методов культивирования микроорганизмов. Но к сожалению, чтобы сдать экзамен надо знать всех прародителей, так как университетская программа отстает от современности нашего мира.
Статья получилось скучной и грустной, но к сожалению эту тему можно "понять" только зубрешкой) Всем удачных сдач и пересдач))
Список литературы и я не буду ее оформлять в соответствии с ГОСТом:
МИКРОБИОЛОГИЯ Л. М. Закарян, Российские рекомендации по клинической микробиологии (Методы посева биоматериала на питательные
среды) 2025 г. и немного картинок из интернета.