Когда появились первые трансгенные животные, это стало настоящим прорывом для биомедицины. Они позволили не только глубже понять, как работают клетки и органы, но и вплотную подойти к изучению человеческих заболеваний. Например, моделировать наследственные болезни: в самом простом случае — с одной мутацией в одном гене (как при муковисцидозе), в более сложных — когда задействованы десятки генов.
Эти модели становятся своего рода “живыми лабораториями”, где можно безопасно тестировать потенциальные подходы к терапии. А дальше технологии, применявшиеся на животных, уже начинают использоваться в генной и клеточной терапии людей. Подробнее — в сегодняшнем статье!
С момента появления первых трансгенных животных в 1970–80-е годы их стали использовать для фундаментальных исследований в биологии.
Новые модели принесли большую пользу в исследовании клеточных и физиологических механизмов, изучение которых было невозможно на культурах клеток. Также благодаря появлению трансгенных животных стало возможно моделировать заболевания человека, изучать их механизмы и искать эффективное лечение.
В самом простом варианте болезнь может быть связана с мутациями в одном гене. Это характерно для многих орфанных заболеваний — например, для муковисцидоза, о трансгенной модели которого мы расскажем ниже более подробно. Но гораздо чаще заболевания связаны с целым набором мутаций в разных генах, которые еще нужно выявить и описать. В таком случае перед учеными стоит задача исследовать конкретные гены, которые вызывают заболевание. И с этой задачей помогают справиться уже хорошо изученные виды животных — те самые модельные организмы.
Например, для исследований нейродегенеративных заболеваний человека используют нематоду Caenorhabditis elegans, о чем мы тоже расскажем в этой главе статьи. С другой стороны, речь может идти об использовании трансгенных моделей для поиска лекарственных препаратов или новых схем лечения заболеваний человека. Тогда очень важно получить модель, которая будет максимально приближена к человеку. Здесь большим достижением стало появление гуманизированных моделей животных, которым пересажены отдельные клетки человека или целые ткани и органы. Самым распространенным гуманизированным животным стала мышь, которой активно пересаживают компоненты иммунной системы, кожи, клетки печени, островков Лангерганса поджелудочной железы и многое другое. Кроме того, развитие технологий, описанных в предыдущем разделе, подготовило почву для переноса технологий модификации генома с животных на человека. Подробнее о результатах этой работы вы можете прочитать в других статьях нашего спецпроекта «Генная и клеточная терапии».
Трансгенные животные и рак молочной железы
Онкологические исследования стали одной из основных областей использования трансгенных животных. Высокое сходство генов человека и мыши, участвующих в механизмах онкогенеза, сделало последнюю отличным модельным животным для этих исследований. В рамках этой статьи мы сосредоточимся только на моделях рака молочной железы — одном из самых распространенных онкологических заболеваний. По данным ВОЗ, рак молочной железы по распространенности занимает второе место в мире (11,6% или 2,3 млн заболевших из всех случаев онкологических заболеваний по данным на 2022 год), уступая только раку легких (12,4% или 2,5 млн случаев).
Появление таргетной и иммунотерапии в онкологии значительно обогатило арсенал средств лечения рака и позволило улучшить прогнозы лечения и уменьшить побочные эффекты. Однако пациенты по-разному реагируют на терапию из-за индивидуальных особенностей развития опухолей. Поэтому очень важен поиск надежных биомаркеров, которые помогут выбрать наиболее эффективную терапию. Онкогенез — очень динамический процесс, в ходе которого происходят многочисленные генетические и эпигенетические изменения, а различные способы лечения могут даже подстегивать процессы эволюции опухолей. Кроме того, раковые клетки крайне гетерогенны генетически и фенотипически, что осложняет моделирование опухолей in vitro. В настоящее время исследования in vitro постоянно развиваются, появляются все новые подходы, такие как создание органоидов (опухолевых тканей, обладающих внутренней структурой, имитирующей реальную опухоль). Однако все эти модели не могут в полной мере отражать динамические изменения опухоли в живом организме.
В исследовании рака на животных используют два основных подхода. Первый заключается в применении ксенографтных моделей животных, которым были пересажены либо фрагменты опухолей пациентов (модель PDX — patient-derived xenograft model), либо клетки опухолевых клеточных линий человека. Это позволяет отслеживать развитие конкретных видов раковых опухолей и определенных генов, сыгравших ключевую роль в их развитии. В настоящее время создано множество ксенографтных моделей разных видов рака, которые позволяют точно имитировать определенные подтипы заболевания.
Несмотря на большие успехи в разработке таких моделей, у них есть и ограничения, касающиеся в первую очередь взаимодействия человеческой опухоли и иммунитета животного. В частности, приходится использовать для этой цели «голых» мышей без иммунной системы, чтобы человеческие клетки не отторгались. Такие модели, следовательно, практически упускают из вида важный аспект взаимодействия иммунной системы и опухоли. Одно из решений — мыши с гуманизированной (то есть частично очеловеченной) иммунной системой, которые с успехом применяются для изучения иммуноонкологических препаратов, моделирования инфекций и аутоиммунных заболеваний. Таких мышей получают генетической модификацией с помощью описанных выше методов, заменяя мышиный ген, кодирующий какой-либо белок иммунной системы, на гомологичный человеческий.
Второй подход представляет собой создание генномодифицированных мышей, которые больше подходят для изучения роли конкретных генов в развитии рака. Существует несколько способов вызвать у мышей развитие опухоли. Самый старый и простой — использование химических канцерогенов, которые вызывают генетические изменения, провоцирующие развитие опухоли. Однако такие модели вызывают малопредсказуемую картину развития рака, что ограничивает их использование. Другой подход — собственно внесение генетических изменений с использованием специфических инструментов, описанных выше. Здесь исследовательская мысль пошла по двум путям:
- создание моделей, экспрессирующих чужеродные (трансгенные) протоонкогены, кодирующие белки, вовлеченные в регуляцию клеточного деления и способные вызвать злокачественное перерождение клеток;
- удаление генов — супрессоров опухолей, которые кодируют белки, защищающие клетку от перехода на скользкую дорожку онкогенеза.
Для поиска лекарственных препаратов и изучения их эффективности используются трансгенные модели мышей, у которых развитие опухолей происходит в определенный период их жизни под влиянием конкретных факторов (например, какого-то химического вещества). Для этого протоонкогены экспрессируются в областях генома, которые находятся под контролем ряда тканеспецифичных промоторов — участков ДНК, активных именно в клетках молочной железы. Эти промоторы активируются под действием разнообразных факторов. Так, например, промотор вируса опухоли молочной железы у мышей (MMTV) начинает работать при половой зрелости, беременности или лактации. Другим способом активировать онкогенез клеток может уже знакомая нам рекомбиназа Cre. Если тканеспецифичный промотор позволяет управлять экспрессией онкогена, то система Cre-LoxP также может либо активировать экспрессию протоонкогена за счет специфической рекомбинации или подавлять экспрессию генов супрессии опухолей за счет вырезания участка гена.
Сверхэкспрессия или повышенная активность рецепторов (HER2) на клеточной поверхности часто наблюдаются при метастатическом раке молочной железы, в связи с чем эти рецепторы стали привлекательными мишенями для лекарственных средств. А мышь со сверхэкспрессией рецептора HER2 стала первой моделью рака молочной железы еще в далеком 1988 году. Далее эта технология постепенно совершенствовалась, а скорость, частота развития и агрессивность опухоли увеличивались по сравнению с первыми экспериментами.
В размножении клеток и росте тканей огромную роль играют белки — ростовые факторы. Многие из способны запустить и рак, поскольку такие молекулы служат сигналом для клеток на рост и деление. Эти ростовые факторы доставляют много хлопот онкологам, вызывая метастазирование опухолей. Наиболее заметную роль в патогенезе рака молочной железы играют трансформирующий фактор роста β (TGFβ) и инсулиноподобные факторы роста I и II (IGF1 и IGF2). Поэтому трансгенные модели мышей со сверхэкспрессией самих ростовых факторов или их рецепторов находят применение в онкологических исследованиях. Однако полученные в таких исследованиях данные зачастую сложно перенести на человека, чем объясняется практически полное отсутствие успешных клинических испытаний препаратов, исследованных на подобных моделях.
Предпринимались попытки разработать ингибиторы рецептора IGF1 (IGF-1R) для лечения рака — первый такой препарат вошел в клинические исследования в 2003 году, и с тех пор в 183 исследованиях побывали 16 препаратов. Однако ни один не был одобрен, несмотря на хорошие данные на мышах, что иллюстрирует сложность трансляции доклинических данных в клинику.
Несмотря на такое высокое разнообразие моделей, специалисты призывают с большой осторожностью сопоставлять модели животных и подтипы рака молочной железы, а также соотносить полученные на этих моделях результаты с данными ксенографтных моделей. Несмотря схожий набор генов, вовлеченных в развитие того или иного подтипа рака, онкологи отмечают, что механизмы канцерогенеза таки сильно отличаются, что необходимо учитывать при переносе данных с животных моделей на человека, особенно трактуя результаты испытаний лекарственных препаратов. В настоящее время трансгенные мышиные модели используются для исследования механизмов канцерогенеза, а также в изучении активности препаратов, направленных на профилактику рака молочной железы, например, такого ретиноида как Bexarotene (Targretin).
Трансгенные животные и заболевания центральной нервной системы
Исследование заболеваний нервной системы человека — очень сложная задача, ведь зачастую причиной болезни может быть не один, а множество генов и белков. Наиболее известны тут болезни Альцгеймера (БА) и Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз, хорея Гентингтона и другие. Кстати, им посвящена отдельная статья спецпроекта по нейрофармакологии. Подтверждает сложность исследования этих заболеваний и печальная статистика разработки лекарственных препаратов — огромное количество клинических испытаний закончились практически безрезультатно. Другая группа заболеваний с явной наследственной компонентой — это психиатрические заболевания, такие как шизофрения, синдром дефицита внимания, посттравматическое стрессовое расстройство и многие другие. Животным моделям таких болезней посвящена статья на «Биомолекуле»: «Трансляционная психиатрия — как моделировать психические расстройства на животных?».
Нейродегенеративные и психиатрические заболевания объединяет не только нарушение функций ЦНС, но и явная наследственная передача симптомов, а также сложность в установлении конкретных генов, вовлеченных в развитие болезни. Стратегии изучения механизмов развития этих заболеваний очень разнообразны. Часть моделей имитирует в основном определенные симптомы и не затрагивает геном; они создаются при помощи определенных химических веществ. В качестве примера таких фармакологических моделей можно вспомнить ротенон-индуцируемую и галоперидоловую модели БП или введение бета-амилоида для модели БА. Некоторые исследователи используют модели животных, у которых строение мозга максимально похоже на человека. Тогда выбор ученых падает на млекопитающих, и особенно на других приматов. Однако у этих моделей тоже есть свои ограничения, ведь нейронная сеть многих млекопитающих практически так же сложна, как и у человека, что затрудняет изучение молекулярных механизмов развития болезни. Чтобы изучить состояние отдельных нейронных цепей, а то и единичных клеток при той или иной мутации, нужна простая, понятная и хорошо изученная нервная система. И здесь на помощь исследователям приходят модели беспозвоночных: нематод, насекомых, моллюсков и рыб.
Старый друг приходит на помощь
Caenorhabditis elegans — один из классических организмов, широко используемый в эмбриологии, цитологии и, в том числе, в нейронауках. Только посмотрите, с какой любовью к этому милому червю пишет Марина Слащева в статье «Модельные организмы: нематода»! Все дело в том, что C. elegans — организм с детерминированным, то есть строго определенным количеством клеток, а также полностью секвенированным геномом, что позволяет не только найти аналогичные человеческому гены, но и, используя специфические промоторы, внести генетическое изменение именно в те клетки, которые хочет исследователь.
Благодаря базе ортологов OrthoList2 для C. elegans известно 7943 гена-ортолога человеческих генов, что составляет 41% генома нематоды. Кроме того, C. elegans — тот редкий организм, для которого описан коннектом — вся нейронная сеть со всеми клетками и синапсами в них! Таким образом, в C. elegans можно внести изменения в конкретный ген конкретной линии нейронов, а если вместе с трансгеном в те же клетки поместить флуоресцентный белок, то за счет того, что нематода практически полностью прозрачна, можно визуализировать изменения, сопровождающие нейродегенерацию. Это в конечном счете позволяет точно связывать гибель или дисфункцию определенных клеток и фенотипические проявления заболевания.
Аналогичные по происхождению и выполняемым функциям гены организмов разных видов называются ортологами. А те гены, которые возникают в результате дупликации и затем приобретают разные функции в ходе эволюции — паралогами.
Болезнь Альцгеймера
Двумя основными молекулярными характеристиками БА считаются наличие в нервной ткани нерастворимых бляшек белков β-амилоида (Aβ) и нейрофибриллярных клубков, связанных с тау-белком. У млекопитающих Aβ накапливается во внеклеточных бляшках, после чего происходит их поглощение соседними клетками. Этот процесс вызывает формирование нейрофибриллярных клубков. У C. elegans нет точного ортолога тау-белка, как и белка-предшественника β-амилоида. Белок APL-1 нематоды является ортологом человеческих белков-предшественников бета-амилоида 1 и 2 (APLP1 и APLP2) и имеет высокий процент сходства с ними. Поэтому моделирование БА у C. elegans в первую очередь сосредоточено на переносе в геном нематоды тех участков генов APLP1 и APLP2, а также MAPT (ген тау-белка), которые сделают их белки максимально похожими на человеческие. Сосредоточив внимание на механосенсорных и глутаматэргических нейронах, исследователям удалось показать признаки нейродегенерации, такие как нейротоксичность амилоидных бляшек. Подобные эксперименты помогли определить ряд генов, которые могут играть роль ингибиторов или стимуляторов нейротоксичности. Например, такими генами стали APOEε2 и APOEε3, чья роль при лечении БА была подтверждена затем в исследовании на крысах.
Болезнь Паркинсона —
второе по распространенности в мире нейродегенеративное заболевание. Самые известные симптомы БП — это тремор и ригидность мышц, которые становятся следствием массовой гибели дофаминергических нейронов в области мозга со зловещим названием «черная субстанция». На «Биомолекуле» выходило множество статей, посвященных исследованию и поиску лекарственных препаратов для лечения этого заболевания. Считается, что всего 10% случаев заболеваний имеют наследственный характер, в то время как остальные 90% возникают более или менее спонтанно. Генетические модели БП связаны с имитированием не всего заболевания, а конкретных его признаков. Такие классические признаки БП как тельца Леви, гибель нейронов в черной субстанции головного мозга или нарушение процессов аутофагии помогают лучше понять вклад генетической компоненты в развитие заболевания.
Тельца Леви содержат белок α-синуклеин. Мутации в этом гене PARK1/SNCA у людей связаны с аутосомно-доминантным типом БП и приводят к нарушению структуры α-синуклеина и формированию телец Леви. У C. elegans есть ортологи PARK1/SNCA, что позволяет исследователям создавать модели сверхэкспрессии α-синуклеина (например, в дофаминергических нейронах C. elegans). Подобные модели широко использовались в сочетании с генетическим и лекарственным скринингом в рамках исследовательского проекта, включающего разные модельные системы (Drosophila, первичная культура мышиных и крысиных клеток). Они позволяют лучше понять влияние конкретных генов на развитие заболеваний и в будущем могут увеличить эффективность поиска лекарственных препаратов для лечения БП.
Трансгенные животные и орфанные заболевания человека
Исследования описанных выше заболеваний оправданы не только гуманистическими взглядами ученых и врачей, но и экономической необходимостью — ведь нейродегенерации и онкологические заболевания приводят к инвалидизации большого количества людей во всем мире, а тенденция к старению населения делает эту проблему еще острее. Однако есть заболевания, которые проявляются редко и встречаются у одного человека из многих тысяч. Это орфанные заболевания, о которых «Биомолекула» писала уже не раз (почитайте статью «Редко, но метко: орфанные заболевания как вызов современной медицине» и другие).
Муковисцидоз —
одно из самых распространенных орфанных заболеваний — 1 случай на 9000 в России (на «Биомолекуле» выходила про него статья «Муковисцидоз — первые надежды»). Это заболевание связано с мутацией в гене CFTR, кодирующем трансмембранный хлоридный канал. Избирательный транспорт ионов через мембрану — один из важнейших процессов для поддержания постоянства внутренней среды в клетке, поэтому такая мутация приводит к нарушениям во множестве органов, в первую очередь — легких и кишечника. В легких мутация в CFTR приводит к нарушению секреции слизи, что приводит к инфекциям дыхательных путей. Если прибавить к этому сопутствующую недостаточность поджелудочной железы, непроходимость кишечника и нарушения работы репродуктивной системы, на выходе мы получаем крайне тяжелое инвалидизирующее и сокращающее жизнь заболевание.
Поскольку при муковисцидозе страдают в первую очередь легкие, напрашивалось решение разработать генную терапию, доставляющую туда вектор с «правильным» геном. Однако все такие попытки раз за разом терпели неудачу, несмотря на многообещающие доклинические исследования. Преодолеть иммунную защиту организма и заразить клетки хоть и «полезным», но все-таки вирусом, оказалось непростой задачей. Воспалительные процессы, сопровождающие заболевание, только усложняли задачу, а слишком плотная слизь на поверхности клеток ставила на пути у вектора физически непреодолимый барьер.
Стало понятно, что подобные неудачи вызваны незнанием деталей строения эпителия дыхательных путей, а «классические» животные модели — мыши — не отражают анатомическое и физиологическое строение дыхательных путей человека. У этих грызунов мутации CFTR у них попросту не приводят к муковисцидозу из-за другого строения и расположения ионоцитов — клеток, несущих этот ионный канал и отвечающих за секрецию слизи. Внимание исследователей переключилось на хорьков — животных, дыхательный тракт которых удивительным образом куда больше похож на человеческий, чем у других мелких млекопитающих. Одним хорькам «удаляли» CFTR, отвечающий за транспорт хлора в ионоцитах; а другим — ген FOX I1, управляющий дифференциацией клеток-предшественников ионоцитов. Все эти манипуляции позволили уточнить, как работают и распределяются ионоциты в дыхательных путях хорьков.
Другая группа уточнила данные, изучив культуру клеток эпителия человека in vitro, и установила более четкий механизм транспорта ионов хлора, а также определила еще ряд транспортеров, участвующих в транспорте ионов и воды через эпителии дыхательных путей.
Таким образом, комбинация методов in vitro (на клетках эпителия человека) и in vivo (на ГМ-хорьках) дает много полезной информаций о механизмах развития легочной недостаточности при муковисцидозе и открывает новые направления для разработки фармпрепаратов. Возможно теперь исследователи будут искать способы альтернативные генной терапии. Компания Spirovant уже начала такие исследования и показала эффективность генной терапии муковисцидоза (с использованием AAV-вектора) на модели трансгенных хорьков.
О том, как создаются трансгенные животные, читайте в нашей новой статье!