Найти в Дзене
Иван Александрович Закурдаев
61 подписчик

Никотин и мелатонин. В чем связь? Макрофаги. Атеросклероз. Часть 3. Заключение.

6
5 мин

Никотин индуцирует пироптоз в макрофагах THP-1. Жизнеспособность обработанных никотином макрофагов THP-1 анализировали с использованием анализа CCK-8 для определения оптимальных условий индукции пироптоза.

Эксперименты с никотином показали, что жизнеспособность макрофагов значительно снижается при воздействии никотина ≥ 5 мкМ в течение 24 часов (рис. 1А).

Никотин индуцирует пироптоз в макрофагах THP-1. (А) Обнаружение жизнеспособности клеток (анализ CCK-8) после 24 часов воздействия различных концентраций никотина. (B-C) Дозозависимая экспрессия мРНК факторов, связанных с пироптозом, в необработанных (контрольных) и обработанных никотином макрофагах (24-часовое воздействие). (D) Дозозависимая экспрессия белков, связанных с пироптозом, в необработанных (контрольных) и обработанных никотином макрофагах (24-часовое воздействие). (D) Зависимая от времени экспрессия белков, связанных с пироптозом, в необработанных (контрольных) и обработанных никотином макрофагах (1 мкМ). (F) Результаты ELISA, показывающие секрецию IL-18 и IL-1β макрофагами, обработанными различными концентрациями никотина в течение 24 часов. (G) Влияние 1 мкм никотина на иммунофлуоресценцию NLRP3 и ASC в макрофагах THP-1 (шкала: 20 мкм). Данные представлены как среднее ±  SD (n = 3 представляет собой три независимых эксперимента на группу); *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками
Никотин индуцирует пироптоз в макрофагах THP-1. (А) Обнаружение жизнеспособности клеток (анализ CCK-8) после 24 часов воздействия различных концентраций никотина. (B-C) Дозозависимая экспрессия мРНК факторов, связанных с пироптозом, в необработанных (контрольных) и обработанных никотином макрофагах (24-часовое воздействие). (D) Дозозависимая экспрессия белков, связанных с пироптозом, в необработанных (контрольных) и обработанных никотином макрофагах (24-часовое воздействие). (D) Зависимая от времени экспрессия белков, связанных с пироптозом, в необработанных (контрольных) и обработанных никотином макрофагах (1 мкМ). (F) Результаты ELISA, показывающие секрецию IL-18 и IL-1β макрофагами, обработанными различными концентрациями никотина в течение 24 часов. (G) Влияние 1 мкм никотина на иммунофлуоресценцию NLRP3 и ASC в макрофагах THP-1 (шкала: 20 мкм). Данные представлены как среднее ±  SD (n = 3 представляет собой три независимых эксперимента на группу); *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками

Таким образом, результаты q-RT-PCR подтвердили, что воздействие на макрофаги 1 мкМ никотина в течение 24 часов индуцировало экспрессию NLRP3, ASC :

  1. каспазы-1 (каспаза-1 представляет собой расщепленную каспазу-1),
  2. IL-18 (IL-18) представляет собой расщепленный IL-18),
  3. IL-1β (IL-1β представляет собой расщепленный IL-1β) (фиг. 1B-C).

Аналогично, результаты вестерн-блоттинга подтвердили результаты q-RT-PCR (рис. 1D-E). Более того, после инкубации с 1 мкМ никотина в течение 24 часов результаты ИФА показали, что уровни IL-18 и IL-1β в супернатантах клеточных культур значительно увеличивались (рис. 1F).

Во время процесса активации воспаления NLRP3 ASC активируется с образованием полимеров. На рис. 1G агрегированные ASC наблюдаются под микроскопом в виде характерных пятен ASC, что является признаком активации воспаления NLRP3 и пироптоза.

Мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин, МТ) далее просто "МТ" ингибирует вызванный никотином пироптоз в макрофагах THP-1.

Мелатонин образуется из триптофана!
Мелатонин образуется из триптофана!

Анализы жизнеспособности клеток не выявили существенных изменений в выживаемости макрофагов THP-1, обработанных никотином (1 мкМ, 24 часа), при введении 0–50 мМ МТ в течение 6 часов (рис. 2А), что указывает на то, что 0–50 мМ МТ вводили в течение 6 часов. – безопасная концентрация для макрофагов, обработанных никотином (1 мкМ никотина, 24 часа).

МТ ингибирует вызванный никотином пироптоз в макрофагах THP-1. (A) Результаты анализа жизнеспособности макрофагов, подвергшихся воздействию никотина (1 мкМ, 24 часа) и обработанных различными концентрациями МТ (6 часов). (B) Экспрессию мРНК NLRP3 и каспазы-1 анализировали с помощью q-RT-PCR в макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа) без MT и макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа), обработанных различными концентрациями MT. (6 ч). (C) Экспрессию белка, связанного с пироптозом, анализировали с помощью WB в макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа) без MT и макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа), обработанных различными концентрациями MT (6 часов). (D) Экспрессию белка, связанного с пироптозом, анализировали с помощью WB в макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа) без MT и макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа), обработанных разным временем инкубации 30 мМ MT. (E) Результаты ELISA показали, что IL-18 и IL-1β секретировались в супернатанте макрофагов (1 мкМ никотина, 24 часа) без обработки МТ или после обработки различными концентрациями МТ (6 часов). Данные представлены как среднее ±  SD (n = 3 представляет собой три независимых эксперимента на группу); *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками
МТ ингибирует вызванный никотином пироптоз в макрофагах THP-1. (A) Результаты анализа жизнеспособности макрофагов, подвергшихся воздействию никотина (1 мкМ, 24 часа) и обработанных различными концентрациями МТ (6 часов). (B) Экспрессию мРНК NLRP3 и каспазы-1 анализировали с помощью q-RT-PCR в макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа) без MT и макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа), обработанных различными концентрациями MT. (6 ч). (C) Экспрессию белка, связанного с пироптозом, анализировали с помощью WB в макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа) без MT и макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа), обработанных различными концентрациями MT (6 часов). (D) Экспрессию белка, связанного с пироптозом, анализировали с помощью WB в макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа) без MT и макрофагах (1 мкМ никотина, 24 часа), обработанных разным временем инкубации 30 мМ MT. (E) Результаты ELISA показали, что IL-18 и IL-1β секретировались в супернатанте макрофагов (1 мкМ никотина, 24 часа) без обработки МТ или после обработки различными концентрациями МТ (6 часов). Данные представлены как среднее ±  SD (n = 3 представляет собой три независимых эксперимента на группу); *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками

Как показано на рис. 2B, C и D, макрофагам THP-1 вводили 1 мкМ никотина в течение 24 часов, а затем обрабатывали различными концентрациями МТ или без МТ в течение 6 часов. Наконец, с помощью q-RT-PCR и WB наблюдалось зависимое от концентрации снижение генов и белков, связанных с пироптозом. Кроме того, результаты ELISA продемонстрировали значительное снижение уровней IL-18 и IL-1β в супернатантах макрофагов, обработанных 1 мкМ никотина, после 6 часов инкубации с 30 мМ МТ по сравнению с контрольной группой (макрофаги, обработанные 1 мкМ никотина). в течение 24 ч) (рис. 2Д). Поэтому концентрация 30 мМ и время воздействия 6 часов были выбраны в качестве оптимальных параметров МТ для характеристики влияния МТ на никотин-индуцированный пироптоз в макрофагах THP-1.

МТ ингибирует каспаза-1-зависимый пироптоз в макрофагах THP-1, индуцированный никотином

МТ ингибирует каспаза-1-зависимый пироптоз в макрофагах THP-1, индуцированный никотином. (A) RT-qPCR-анализ влияния ингибирования каспазы-1 на экспрессию мРНК, связанную с пироптозом. (B) WB-анализ влияния ингибирования каспазы-1 на белки, связанные с пироптозом. (C) Выбор сегмента интерференции каспазы-1. (D) WB-анализ влияния нокдауна каспазы-1 на белки, связанные с пироптозом. (E) Влияние MT или VX-765 на иммунофлуоресценцию NLRP3 и IL-18 в макрофагах, обработанных никотином (шкала: 20 мкм). Данные представлены как среднее ±  SD (n = 3 представляет собой три независимых эксперимента на группу); *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками. #P < 0,05, ##P < 0,01 и ###P < 0,001 по сравнению с клетками, обработанными никотином
МТ ингибирует каспаза-1-зависимый пироптоз в макрофагах THP-1, индуцированный никотином. (A) RT-qPCR-анализ влияния ингибирования каспазы-1 на экспрессию мРНК, связанную с пироптозом. (B) WB-анализ влияния ингибирования каспазы-1 на белки, связанные с пироптозом. (C) Выбор сегмента интерференции каспазы-1. (D) WB-анализ влияния нокдауна каспазы-1 на белки, связанные с пироптозом. (E) Влияние MT или VX-765 на иммунофлуоресценцию NLRP3 и IL-18 в макрофагах, обработанных никотином (шкала: 20 мкм). Данные представлены как среднее ±  SD (n = 3 представляет собой три независимых эксперимента на группу); *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками. #P < 0,05, ##P < 0,01 и ###P < 0,001 по сравнению с клетками, обработанными никотином

Мы использовали VX-765, мощный и селективный ингибитор каспазы-1, для анализа экспрессии генов и белков, связанных с пироптозом. Результаты q-RT-PCR и WB показали, что никотин-индуцированная экспрессия каспазы-1, IL-18 и IL-1β значительно снижалась при обработке VX-765 (10 мкМ) или МТ (30 мМ) (рис. 3А). -Б). Чтобы дополнительно изучить взаимосвязь между пироптозом и каспазой-1, мы нейтрализовали каспазу-1 с помощью миРНК (рис. 3C). В соответствии с предыдущими результатами, экспрессия IL-18 и IL-1β снижалась в обработанных никотином макрофагах THP-1 после нокдауна каспазы-1, в то время как уровни NLRP3 и ASC не менялись (рис. 3D). Более того, результаты иммунофлуоресценции были согласованными (рис. 3E), демонстрируя, что никотин-индуцированная воспалительная гибель клеток зависит от каспазы-1.

Это открытие предполагает, что экспрессия IL-18 и IL-1β снижалась в обработанных никотином макрофагах THP-1 после нокдауна каспазы-1, которая была вызвана введением мелатонина.

То есть простыми словами мелатонин уменьшает воспаление в стенке сосуда, блокирую провоспалительную работу макрофага, а значит стабилизирует атеросклеротическую бляшку и прогрессирование в ней воспаления.

Схематическое изображение воздействия МТ на обработанные никотином макрофаги THP-1. Воздействие никотина индуцирует выработку АФК, что способствует образованию воспаления NLRP3, что приводит к активации каспазы-1. Активированная каспаза-1 запускает пироптоз посредством образования мембранных пор, фрагментации ДНК и высвобождения зрелых IL-1β и IL-18. Возникшее стерильное воспаление способствует прогрессированию АС. Более того, MT нормализует экспрессию Sirt3 и способствует экспрессии FOXO3α в макрофагах, обработанных никотином. Это снижает выработку АФК и предотвращает окислительный стресс, который ингибирует образование воспаления NLRP3 и предотвращает пироптоз. Процесс, посредством которого МТ ингибирует никотин-индуцированный пироптоз, также включает апоптоз, который происходит главным образом за счет взаимодействия между каспазой-1 и каспазой-3. ↑ вызвать; ⊥ подавлять
Схематическое изображение воздействия МТ на обработанные никотином макрофаги THP-1. Воздействие никотина индуцирует выработку АФК, что способствует образованию воспаления NLRP3, что приводит к активации каспазы-1. Активированная каспаза-1 запускает пироптоз посредством образования мембранных пор, фрагментации ДНК и высвобождения зрелых IL-1β и IL-18. Возникшее стерильное воспаление способствует прогрессированию АС. Более того, MT нормализует экспрессию Sirt3 и способствует экспрессии FOXO3α в макрофагах, обработанных никотином. Это снижает выработку АФК и предотвращает окислительный стресс, который ингибирует образование воспаления NLRP3 и предотвращает пироптоз. Процесс, посредством которого МТ ингибирует никотин-индуцированный пироптоз, также включает апоптоз, который происходит главным образом за счет взаимодействия между каспазой-1 и каспазой-3. ↑ вызвать; ⊥ подавлять

Kesavardhana S, Malireddi RKS, Kanneganti TD. Caspases in cell death, inflammation, and Pyroptosis. Annu Rev Immunol. 2020;38:567–95. doi: 10.1146/annurev-immunol-073119-095439. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Liu Z, Gan L, Xu Y et al. (2017). Melatonin alleviates inflammasome-induced pyroptosis through inhibiting NF-κB/GSDMD signal in mice adipose tissue. J Pineal Res, 63(1). [PubMed]

Miao Z, Miao Z, Teng X, et al. Melatonin alleviates lead-induced intestinal epithelial cell pyroptosis in the common carps (Cyprinus carpio) via miR-17-5p/TXNIP axis. Fish Shellfish Immunol. 2022;131:127–36. doi: 10.1016/j.fsi.2022.09.071. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Arioz BI, Tastan B, Tarakcioglu E, et al. Melatonin attenuates LPS-Induced Acute Depressive-Like behaviors and Microglial NLRP3 inflammasome activation through the SIRT1/Nrf2 pathway. Front Immunol. 2019;10:1511. doi: 10.3389/fimmu.2019.01511. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Kunitomo M, Yamaguchi Y, Kagota S, et al. Biochemical evidence of Atherosclerosis progression mediated by increased oxidative stress in apolipoprotein E-deficient spontaneously hyperlipidemic mice exposed to chronic cigarette smoke. Pharmacol Sci. 2009;110:354–61. doi: 10.1254/jphs.09100FP. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Centner AM, Bhide PG, Salazar G. (2020). Nicotine in Senescence and Atherosclerosis. Cells. 22;9(4):1035. [PMC free article] [PubMed]

Szostak J, Wong ET, Titz B, et al. A 6-month systems toxicology inhalation study in ApoE–/– mice demonstrates reduced cardiovascular effects of E-vapor aerosols compared to cigarette smoke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2020;318:H604–31. doi: 10.1152/ajpheart.00613.2019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Edmonds KE, Stetson MH. Photoperiod and melatonin affect testicular growth in the marsh rice rat (Oryzomys palustris) J Pineal Res. 1994;17(2):86–93. doi: 10.1111/j.1600-079X.1994.tb00118.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Edmonds KE, Stetson MH. Pineal gland and melatonin affect testicular status in the adult marsh rice rat (Oryzomys palustris) Gen Comp Endocrinol. 1995;99(3):265–74. doi: 10.1006/gcen.1995.1110. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Liu J, Clough SJ, Hutchinson AJ, et al. MT1 and MT2 melatonin receptors: a therapeutic perspective. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015;56:361–83. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010814-124742. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Horton WJ, Gissel HJ, Saboy JE, et al. Melatonin administration alters nicotine preference consumption via signaling through high-affinity melatonin receptors. Psychopharmacology. 2015;232(14):2519–30. doi: 10.1007/s00213-015-3886-1. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Zeidler R, Albermann K, Lang S. Nicotine and apoptosis. Apoptosis. 2007;12(11):1927–43. doi: 10.1007/s10495-007-0102-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Han YX, Wang YF, Guan-Jun TU. Cellular apoptosis and Caspase-1 and Caspase-3 expressions following rat spinal cord ischemia/reperfusion injury. Progress of Anatomical Sciences; 2011.

Cong L, Bai Y, Guo Z. The crosstalk among autophagy, apoptosis, and pyroptosis in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 2022;9:997469. [PMC free article] [PubMed]

McArthur K, Whitehead LW, Heddeston JM, et al. BAK/BAX macroores facility mitochondrial inheritance and mtDNA efflux during Apoptosis Science 2018;359(6378):eaao6047. [PubMed]