Приветствую, уважаемые читатели. В одной из заметок было упомянуто исследование советским физиком Евгением Завойским явления парамагнитного резонанса. К настоящему времени на этом эффекте основан своеобразный метод научных исследований, который хочу описать подробнее.
Для начала напомню, что электроны в атоме обычно располагаются на орбиталях попарно, так что их магнитные моменты ориентируются противоположно и взаимно скомпенсированы. Такие вещества почти не проявляют магнитных свойств (являются диамагнетиками). Другая ситуация, если в атоме/молекуле присутствует один неспаренный электрон (например, в свободных радикалах); или несколько таких неспаренных электронов распределены по разным орбиталям (как в переходных металлах). В этом случае при приложении внешнего магнитного поля спиновые моменты электронов разворачиваются параллельно линиям поля, и вещество намагничивается. Такие вещества называют парамагнетиками. Однако некоторая доля электронов разворачивается антипараллельно полю. Вообразите себе такую аналогию: ветер выравнивает флюгеры на крышах домов в одну сторону, но небольшая их доля встаёт против ветра; все же прочие состояния неустойчивы и не существуют. (рис. 1)
Понятно, что потенциальная энергия электрона, направленного вдоль поля — минимальна, а электрона против поля несколько больше. Такое расщепление энергий электронов в магнитном поле влияет на положение линий поглощения и излучения в оптических спектрах, что называют эффектом Зеемана. Пример показан на рис. 2: каждый из двух уровней энергии расщепляется надвое, благодаря чему вместо одного возможного перехода возникает четыре, что соответствует четырём энергиям (частотам, длинам волн, цветам) испускаемого излучения.
Если же на вещество в магнитном поле падает излучение, энергия которого равна разности подуровней зеемановского расщепления — это излучение может поглотиться, электрон будет «заброшен» на верхний подуровень (перейдёт из положения «по ветру» в положение «против ветра» в нашей аналогии). Это явление — и есть открытый Завойским электронный парамагнитный резонанс; в англоязычной литературе ещё называют "электрон-спиновый резонанс", ЭПР, EPR, ESR.
После столь длинного введения перейдём к тому, как и зачем исследуют спектры ЭПР. Напомню, что спектром в узком смысле называют распределение интенсивности колебаний в неком сигнале в зависимости от из частоты/длины волны. Это распределение может быть дискретным (линейчатым) или непрерывным. (Рис. 3)
Энергии поглощения эффекта ЭПР лежат в области сверхвысокочастотного излучения. Обеспечить плавное изменение падающего света в оптической спектроскопии не проблема: лампа, испускающая белый свет; призма или дифракционная решётка да поворачивающий механизм. Изготовить же генератор СВЧ-волн, способный плавно менять рабочую частоту в сколь-нибудь большом диапазоне — крайне сложная техническая задача. Тут Завойскому и продолжателям его дела пришлось пойти на хитрость. Вспомним, что условием резонансного поглощения является равенство энергии падающего излучения и энергии расщепления, зависящей от напряжённости внешнего магнитного поля. Кратко это выражается формулой hν = E = gβH, где h — постоянная Планка, ν — частота излучения, β — магнитная постоянная, H — напряжённость внешнего магнитного поля, g — коэффициент пропорциональности между всеми этими параметрами. (Рис. 4)
Не обязательно плавно менять частоту и измерять, на какой частоте какая доля излучения поглотилась веществом, как делается в оптической спектроскопии. Вместо этого можно взять СВЧ-генератор с фиксированной частотой, и плавно менять напряжённость поля, создаваемого мощными электромагнитами, а измерять коэффициент пропорциональности (g-фактор). Вот этот g-фактор и есть основная характеристика ЭПР-спектров. Если в оптической спектроскопии говорят, например, «максимум поглощения такого-то вещества при длине волны 366 нанометров», то здесь аналогом будет «пик поглощения на g-факторе 2,03». Величина это безразмерная, расстояние между разными g-факторами выражают в единицах магнитного поля — гауссах или миллитеслах. [Здесь могло быть много математики с пояснениями, что такое фактор Ланде и как он формируется, но давайте скажем, как пишут в учебниках, он «зависит от природы вещества».]
Прибор ЭПР-спектрометр представляет собой мощные электромагниты, между которыми расположен резонатор. Резонатор — позолоченный медный паралелепипед тщательно рассчитанной формы, так, чтобы линии магнитного поля были совершенно ровными и параллельными в том месте, куда вставляется исследуемый образец. Возбуждающее излучение создаётся СВЧ-генератором — практически таким же, какие применяют в радиолокаторах. Излучение направляется по медному волноводу на резонатор с образцом, а затем на детектор. Для улучшения чувствительности к линейно изменяющемуся магнитному полю добавляется составляющая, изменяющаяся с небольшой амплитудой по синусоидальному закону. Детектор же записывает не интенсивность дошедшего на него излучения, а скорость его изменения, т. е. производную (рис. 5).
Для чего же может пригодиться СВЧ-спектроскопия? Для начала, это исследование строения молекул. По значению g-фактора можно вычислить энергию электронного подуровня. Ширина линии зависит от способности передавать энергию соседним, не резонирующим неспаренным электронам (спин-спиновое взаимодействие) или просто окружающим атомам и молекулам (спин-решёточная релаксация). Ядра атомов тоже могут быть парамагнитными; их магнитные поля взаимодействуют с электроном, вызывая аналогичное эффекту Зеемана расщепление ЭПР-перехода — "сверхтонкую структуру" спектра, СТС. Если электронная орбиталь имеет сферическую форму или молекула свободно вращается в растворе, то её ориентация относительно внешнего магнитного поля не имеет значения. В твёрдых и замороженных образцах плоское или вытянутое электронное облако даст два значения g-фактора: продольное и поперечное, а асимметричное облако даст три значения по трём измерениям. Все эти детали дают важную информацию для квантовомеханических расчётов, иногда форму молекулы можно вычислить по одному ЭПР-спектру, не говоря уже о дополнении другими методами исследований.
Другое применение ЭПР-спектроскопии — качественный и количественный анализ уже известных веществ по характерному для них спектру. Спектр специфической формы можно разглядеть даже в сложных многокомпонентных смесях — например, ткани живого организма. Площадь под кривой спектра пропорциональна количеству резонирующих электронов. Чтобы избежать сложных расчётов при каждом измерении, обычно готовят образец с точно рассчитанной концентрацией, массой, в определённых условиях, а потом просто сравнивают измеренные спектры с этой калибровочной записью. При качественно изготовленном приборе и умелом операторе метод позволяет достигать высочайшей чувствительности, замечая вещества в концентрации порядка 10^-8 (одна стомиллионная) моль на литр. (Напоминаю, что моль поваренной соли - это 58,5 г, моль сахара - 342 г.)
Можно наблюдать и кинетику изменения веществ в процессе химических реакций. Если реакция не слишком быстрая, достаточно поместить реакционную смесь в прибор и считывать спектр каждые n секунд/минут. Для быстрых реакций можно выжать информацию из стационарного значения концентрации: некоторые свободные радикалы распадаются за миллисекунды, но и новые формируются с той же скоростью.
Наконец, можно воспользоваться ЭПР-спектроскопией, даже если интересующий нас объект не обладает парамагнетизмом. Для этого применяются "спиновые метки/зонды" — вещества, изменяющие свои парамагнитные свойства в зависимости от параметров среды: температуры, кислотности, освещённости, окислительного потенциала и т. п., или специфически соединяющиеся с конкретным исследуемым веществом. Гораздо более известны флуоресцентные метки, но ЭПР на несколько порядков чувствительнее.
И наконец о сильных и слабых сторонах метода.
- Сложность и дороговизна прибора. Настольные модели существуют, но их чувствительность и разрешение оставляют желать лучшего.
- Высокие требования к квалификации оператора и наладчика. Процесс записи зависит от многих нюансов, и не так-то просто подобрать сочетание настроек и режим записи, чтобы выжать максимум из возможностей прибора.
- Объект измерения — исключительно парамагнитные атомы. Хочется посмотреть что-то другое — придётся придумывать, как применить ловушки и зонды.
+ Объект измерения — исключительно парамагнитные атомы. Да, это же и главное достоинство. Избирательность позволяет видеть интересующие нас вещества в составе сложных смесей, в т. ч. биологических объектов, да ещё и наблюдать изменение их состояния в ходе окислительно-восстановительных реакций почти в реальном времени. Существуют импульсные спектрометры, измеряющие амплитуду поглощения на одном g-факторе, но с высокой частотой.
+ Исследуемый образец не тратится и не повреждается в ходе измерения. Его можно позже исследовать другими методами, или кинуть в морозилку и хранить годами.
+ Широта возможностей: как я упоминал выше, можно реализовать качественный, количественный анализ и динамические измерения.
+ Не требуется сложной пробоподготовки, как-то гомогенизации, высушивания, окрашивания, напыления, кристаллизации. Образец может быть жидким, порошкообразным, измельчённым, замороженным.
+ Не требуется дорогих и дефицитных расходников (растворители, красители, среды, праймеры, антитела и т. д.). Единственное, что тратится постоянно — жидкий азот.
Литература:
Д. Ингрэм Электронный парамагнитный резонанс в биологии — М. Мир, 1972
Черкасов В.К., Курский Ю.А. и др. Методы ЭПР и ЯМР в органической и элементоорганической химии — Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 2010
Автор: Николай Ткачев.