Компания Диаэм предлагает реактивы для генной инженерии и молекулярной биологии, в том числе индуктор lac-оперона ИПТГ и хромогенный субстрат X-Gal, используемые для проведения бело-голубого скрининга. Метод бело-голубой селекции – это колориметрическая система отбора рекомбинантных клонов, которая основана на изменении цвета бактериальных колоний в зависимости от наличия или отсутствия генно-инженерной вставки в плазмиде. Это простой и эффективный метод выявления рекомбинантных бактерий в экспериментах по клонированию.
Центральное место в этой технике занимает активность β-галактозидазы, фермента, кодируемого геном lacZ у E. coli, который метаболизирует лактозу с образованием глюкозы и галактозы. В активном состоянии он существует в виде тетрамера. Присутствие лактозы в окружающей среде запускает оперон lacZ в E. coli, что приводит к продукции фермента β-галактозидазы. Большинство плазмидных векторов несут короткий сегмент гена lacZα, который кодирует α-пептид, неактивный сегмент β-галактозидазы. Используемые в клонировании штаммы E. coli представляют собой компетентные клетки, содержащие делеционную мутацию lacZΔM15 и продуцирующие мутантную форму β-галактозидазы , неспособную образовывать тетрамер. Однако, в присутствии α-пептида эта мутантная форма белка может полностью вернуться в свое активное тетрамерное состояние. Восстановление функции мутантной β-галактозидазы с помощью α-пептида называется α-комплементацией.
Альтернативно, β-галактозидаза может гидролизовать другой субстрат, X-Gal, в результате чего образуется производное индиго синего цвета. X-gal, или 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид — хромогенный субстрат для β-галактозидазы, образующий при гидролизе темно-синий продукт.
Процесс α-комплементации используется в качестве маркера рекомбинации. Клонирование чужеродного гена в вектор происходит внутрь гена β-галактозидазы (lacZ) в области MCS (мультиклональный сайт, полилинкер) (рис.1). В результате этого происходит разрыв кодирующей части гена lacZ и инактивация β-галактозидазы.
Для скрининга клонов, содержащих рекомбинантную ДНК, в чашку с агаром добавляют X-gal. Если образуется β-галактозидаза, X-gal гидролизуется с образованием нерастворимого синего пигмента. Поэтому колонии синего цвета образованы клетками, не содержащими вставку. Колонии, несущие рекомбинантную плазмидную ДНК, выглядят белыми из-за нарушения гена lacZ. Для проведения бело-голубого скрининга после трансформации вместе с X-Gal добавляют Изопропил-β-D-тиогалактопиранозид, или ИПТГ, который служит индуктором экспрессии гена lacZ ω.