Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты (клетки), окрашенные специальными красителями (флюорохромами), под действием облучения их ультрафиолетом испускают излучение в видимом спектре света. В случае когда объект не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет, проходя через объектив и попадая на препарат, поглощается молекулярными структурами объекта и остается
невидимым или почти невидимым для человеческого глаза. Если же какие-либо объекты окрашены специальным красителем, то молекулы красителя под действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты света в длинноволновой области (видимой части излучения), иначе говоря – светиться. В этом случае клетка становится источником света определенного спектра (цвета) и хорошо видна на общем темном контрастном фоне препарата.
За счет свечения вокруг бактериальной клетки образуется ореол, благодаря которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры. В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно исследуются при увеличении 250–450×, тогда как окрашенные обычными красителями – при увеличении 800–1000×. Разница в увеличении позволяет микроскописту видеть в люминесцентном микроскопе в 4–10 раз большее поле зрения, что существенно сокращает время, необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что если микроскопическое исследование необходимой площади мазка при классической окраске составляет приблизительно 10–15 минут, то для исследования той же площади мазка методом люминесцентной микроскопии потребуется только 2–3 минуты.
При люминесцентной микроскопии отмечается значительно большая резкость и контрастность микроскопической картины, что повышает комфортность микроскопического исследования. Для глаза исследователя намного легче обнаружить флюоресцирующие оранжевые или ярко-желтые бактерии (при окраске акридиновым оранжевым) на темном или темно-красном фоне, чем выявить красные бактерии на ярком фоне клеточного детрита. Это делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала (т.е. в условиях малого количества бактериальных клеток). Чувствительность люминесцентной микроскопии, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), приближается к чувствительности метода посева.