Я уже написала несколько статей про выделение ДНК, постановку ПЦР, постановку геля-электрофореза и очистку ПЦР-продукта. Тогда я уже упоминала про некоторые ошибки, но решила написать про них отдельно.
Первая проблема, особенно у тех, кто только начинает работать с новой группой - это отсутствие полосок на геле после постановки гель-электрофореза для ПЦР-продуктов. Если вы столкнулись с этой проблемой, то ничего страшного. Нужно просто хорошо проанализировать ситуацию, попробовать разные варианты, и в итоге все получится. Поэтому я всегда рекомендую для начала взять 4-7 образцов из материала, который не жалко, и для которого много дублей. Ну и, конечно, если у вас совсем нет опыта с молекулярными работами, лучше всего выбрать проект, где минимум редких невосполнимых образцов.
Почему может быть так, что вы исполнили все этапы, по протоколам, которые работают у других, но у вас ничего не получилось? Начнем с того, что можно легче всего исправить, а именно с геля-электрофореза. Это исправить легче всего, просто надо переставить гель, потратив еще немного ПЦР-продукта. Как узнать, что у вас возможно проблемы с гелем? Для этого нужно обязательно использовать маркер длин. Если он ярко светится, значит, скорее всего, с гелем все ок. Если его не видно или он бледный, то скорее всего что-то не так. Также можно в одной из лунок использовать положительный контроль, то есть пробирку, в которой точно есть ПЦР-продукт высокой концентрации. Однако такие образцы не всегда есть в наличии или их не хочется тратить на то, чтобы протестировать ошибки на геле. Про гель я подробно написала здесь и здесь.
Что могло пойти не так?
- Вы поставили ДНК на слишком долгое время или при слишком высоком напряжении (или и то, и другое), и ваша ДНК у вас утекла за пределы геля.
- Вы неправильно расположили гель в ванночке, и ваша ДНК ушла за пределы геля. Помните, в ванночках для геля ДНК всегда идет от черной полоски к красной.
- Вы слишком рано сняли гель или сделали слишком маленькую концентрацию, и он получился слишком жидким. Лунки получились мятыми или с перфорациями и ДНК вылилась за пределы лунок (кстати, в это случае все же полоски от маркера длин могут получиться четкими, если первая лунка в порядке). Но обычно, все же, не все лунки получаются плохими, и в этом случае на геле что-то будет светиться.
- Вы вливаете ДНК не в лунки, а втыкаете носики в гель. Ваша ДНК растекается внутри геля, а не внутри лунок, и полоски не получаются.
- По какой-то причине, ток не пошел. Может быть вы забыли включить прибор или плохо присоединили электроды. Если ток идет, то у черной линии появляются пузырьки. Если их нет, это означает, что ток не идет.
- Одна из самых распространенных ошибок - вы забыли добавить в гель краситель (бромистый этидий или SYBRGreen).
- Также можно забыть смешать ДНК с красителем. Но в этом случае, будут видны полоски от маркера длин, но не будет видно положительного контроля.
Еще имеет смысл измерить концентрацию ПЦР продукта в пробирках. Если его хотя бы 20 нг/мкл, то он должен проявиться на геле. Если его концентрация ниже, то, скорее всего, проблема не в геле.
Если вы исключили все проблемы с гелем, значит что-то пошло не так на более ранних этапах. Возможно, вы что-то не учли на этапе постановки ПЦР. Опять-таки, все проблемы с ПЦР можно исключить сразу же, если вы измерили концентрацию тотальной ДНК (и она нормальная), а ПЦР продукта очень мало или вообще нет. Это означает, что ПЦР не прошла. Про то, как ставить ПЦР и что для этого нужно, я подробно написала здесь и здесь.
- Первое, о чем надо подумать - это просроченные или испорченные реактивы. В норме реактивы для ПЦР хранятся в морозилке довольно долго, 2-3 года точно, а то и дольше, особенно, если их не размораживать. Однако, разумеется, в лабораториях реактивы могут находиться и дольше. Также они могли испортиться по другим причинам. Например, Taq-полимеразу достаточно оставить в холодильнике на неделю или на столе на 1-2 дня, чтобы она потеряла свои ценные качества. Праймеры, если их периодически размораживать, хранятся примерно 3 года. По этой причине, если вы пришли в новую лабораторию, то лучше иметь все свежее и свое, ну или иметь веские основания быть уверенным, что вам выдают качественные реактивы.
- Вторая очень популярная причина того, что ПЦР не получилась, - это неподходящие праймеры. И это самый непредсказуемый фактор (см. подробности здесь). Что тут можно сделать? Спросить совета у более опытных коллег, которые работают по вашей группе или близким группам. Попробовать разные праймеры, включая универсальные. Может быть, даже можно сменить маркер, и попробовать другой. Обычно, если получается результат хотя бы с одним маркером, уже можно сделать какие-то выводы о том, что делать дальше.
- Если праймеры должны работать, посмотрите протокол для ПЦР. Даже если вы взяли температуру отжига из статьи, не факт, что она будет подходить для вашей группы. И иногда в статьях не указывают полную информацию или вообще могут опубликовать ошибочный протокол (например, человек, который писал текст, сам ПЦР не ставил и что-то перепутал; или, может, скопировал методы из предыдущей статьи и забыл исправить протокол для текущего случая). Так что лучше для новых праймеров всегда ставить градиентную ПЦР, чтобы понять, какие температуры лучше подходят для вашего случая.
- Убедитесь, что вы правильно ввели протокол в ПЦР машинку и ничего не перепутали.
- Обязательно прокрутите пробирки с ПЦР-миксом и ДНК на вортексе до того, как поставите их в ПЦР-машинку. Если ДНК останется на стенке пробирки, то реакция не пойдет.
- Убедитесь, во время подготовки ПЦР микса, вы добавили все ингредиенты. Если вы не добавите Taq-полимеразу или забудете про праймеры, то реакция не пойдет.
Ну и если все же у вас низкие или нулевые концентрации тотальной ДНК, то скорее всего проблема не в ПЦР, а на этапе выделения или подбора образцов. О чем стоит подумать?
- Материал плохого качества. Подумайте, как он хранился? Достаточно ли он свежий? (см. подробности здесь). Для начала, конечно, надо взять материал, которому до 5 лет, и который хранился в морозильнике, ну если и при комнатной температуре, то хотя бы в 95% спирте. Если у вас старый материал или неправильно хранился (например, в формалине), то есть вероятность, что просто для него не подходят стандартные протоколы по выделению ДНК. При выделении, и, соответственно, при ПЦР, у вас получились очень низкие концентрации ДНК, которые не видны на геле. Как это можно проверить? Вы можете измерить концентрацию тотальной ДНК с помощью спектрофотометра или флуориметра. Также примерно прикинуть концентрацию тотальной ДНК можно, поставив с ней гель-электрофорез. Если она не будет светиться на геле, значит, концентрации низкие. Это, конечно, при условии, что вы правильно ставите гель-электрофорез.
- Выбранный способ выделения или набор могут не подойти для ваших целей (подробности см. здесь и здесь).
- Набор в принципе подходит, но есть смысл модифицировать протокол (например, оставлять в лизисном растворе на ночь или уменьшить количество элюирующего раствора).
- Испорченные реактивы. При покупке набора для выделения, надо всегда внимательно читать, что там надо хранить при комнатной температуре, что в холодильнике, что в морозильнике. Причем, в разных наборах могут быть разные условия для аналогичных реактивов. Например, где-то протеинкиназу просят хранить в морозильнике, где-то при комнатной температуре. Также проверьте дату изготовления набора. Возможно, реактивы старые и работают не в полную мощность.
- Убедитесь, что вы храните выделенную ДНК в морозильнике. В холодильнике она быстро испортится.
И еще небольшой комментарий по поводу измерения концентрации. Скорее всего я напишу об этом отдельную статью. Но тут хочу лишь упомянуть, что в любом случае - это также отдельный этап, который занимает время и ДНК (а иногда нужны и отдельные дорогостоящие реактивы). Так что имеет смысл измерять концентрации, если вы хотите вычислить, на каком этапе у вас что-то пошло не так. Если же у вас протоколы отработаны и все получается нормально, измерять концентрацию каждого образца нет большого смысла.
-
-