В предыдущих статьях я уже написала про то, как выделять ДНК (часть 1 и часть 2), как ставить ПЦР (часть 1 и часть 2) и как ставить гель-электрофорез (часть 1 и часть 2). В отношении этих трех пунктов нет сомнений, зачем они нужны. Что касается очистки ПЦР продуктов - это немного спорный момент. Кто-то считает, что очистка обязательно нужна, кто-то в норме ПЦР продукты не очищает. Надо сказать, что очистка ПЦР продукта - это допонительный этап, который может занимать 1-2 часа, а то и полдня, и стоить это может тоже прилично (зависит от количества образцов и выбранного способа очистки). Давайте разберемся, что это, и нужно ли. А если нужно, то в каких случаях.
После того, как проходит ПЦР реакция, обычно в пробирке находится много отрезков ДНК, и не обязательно все, что там есть, нам нужно. Кроме нашей целевой ДНК, в пробирке как минимум всегда есть остатки праймеров. Могут быть еще какие-то мелкие кусочки ДНК, которые амплифицировались в ходе этой реакции, но не являются нашей целевой ДНК. Если образец был свежий, ДНК почти не деградирована, то скорее всего процент таких вот кусочков и праймеров по сравнению с целевым фрагментом будет небольшим. Если же качество ДНК не очень хорошее, то, разумеется, процент нецелевых фрагментов будет возрастать.
С помощью очистки ДНК мы как раз и избавляемся от таких вот мелких фрагментов, которые могут повлиять на результат секвенирования, и в итоге мы увидим не чистую последовательность нуклеотидов, а много двойных пиков, и будет не понятно, что из этих пиков относится к нужной последовательности.
Чем выше качество наших целевых фрагментов и чем больше их в пробирке, тем легче их будет отсеквенировать. Для таких случаев очистка может и не понадобится, и будет скорее тратой времени и денег. Чем грязнее ПЦР-продукт, тем сложнее его отсеквенировать. В таких случаях, очистка нужна.
Как узнать, насколько у вас чистый и концентрированный ПЦР продукт и стоит ли вам проводить очистку? Это нельзя определить на 100% до секвенирования. Однако есть индикаторы, с помощью которых можно сказать, что продукт скорее всего грязный, и очистка нужна.
Во-первых, можно сделать предположения исходя из качества ваших образцов. Если вы знаете, что ваши образцы свежие и правильно хранились, и вы используете специфические праймеры, то скорее всего выход ПЦР будет хорошим.
Во-вторых, чистый ПЦР продукт обычно дает яркую полоску на геле без шмеров (дополнительных полосок), а ПЦР продукт плохого качества обычно бледный и/или со шмерами.
В-третьих, вы можете измерить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра или флуориметра. Для разных длин фрагментов достаточная концентрация разная. Для фрагментов примерно 500 пар нуклеотидов, считается, что достаточная концентрация 40ng/µl. Если фрагмент меньше, то и достаточная концентрация ниже. Также важно значение OD 260/280, оно должно быть между 1.8-2. Если это значение выше или ниже, то, скорее всего, ваш продукт загрязнен.
Исходя из этих критериев, вы можете принять решение, и попробовать отправить ваш фрагмент на секвенирование без очистки. Может выйти так, что у вас все получится хорошо и без нее и вам не надо тратить деньги и время на дополнительный этап.
Есть еще три важных момента.
Необходимость очистки может зависеть не только от качества вашего образца и выхода ПЦР реакции, но также от качества секвенирования. Если на этапе секвенирования используются качественные и непросроченные реагенты в высоких концентрациях, то высока вероятность, что даже ПЦР продукты не самого высокого качества будут неплохо секвенироваться без очистки. Если же, наоборот, реагенты, используемые для секвенирования плохого качества, то даже чистые ПЦР продукты на секвенировании могут получаться не очень хорошо.
Также для одних и тех же образцов, разные фрагменты могут получаться с разным качеством. И для одного фрагмента очистка может понадобиться, а для другого - нет. Могут быть случаи, когда для одного фрагмента может подойти больше видов очистки, а для другого только определенный вид. Например, митохондрий в клетке больше, поэтому при амплификации обычно получается больше копий маркеров из этих органелл, чем копий маркеров из ядерной ДНК. По этой причине, митохондриальную ДНК можно очищать на колонках, при этом немного пожертвуя концентрацией. А вот для ядерной ДНК очистка на колонке может не подойти, потому что итоговая концентрация может оказаться слишком низкой, поэтому такие маркеры лучше очищать с помощью ферментов.
Важно также знать, что очищенный ПЦР продукт можно использовать как матрицу для еще одной ПЦР, для того, чтобы получить более высокую концентрацию ПЦР продукта. Так что если у вас есть бледная полоска на геле, но на секвенрировании стабильно получается выход плохого качества, можно попробоваться такой вариант. Также ДНК продукт можно очищать из геля, в случае если на геле получается двойная полоска. И потом либо использовать для секвенирования, либо также использовать в качестве матрицы для ПЦР, чтобы увеличить концентрацию.
В следующий раз я напишу о способах очистки ПЦР продукта.