Сикстинская Мадонна представляет собой безмятежную, самообладающую Деву Марию с младенцем Христом, женщину идеального материнского великолепия и красоты. Она стоит на облаках спереди и в центре, в развевающихся одеждах, с задернутыми занавесками по обе стороны от нее, чтобы подчеркнуть ее важность. Вид за ее спиной открывается на небеса, где в облаках мелькают лица душ нерожденных детей или ангелов. Два мученика третьего века, святые покровители церкви Сан-Систо, встречают ее. Слева от нее папа Сикст II опускается на колени, чтобы взглянуть на нее, его левая рука прижата к сердцу, а правой рукой он приглашает зрителя подойти. Справа святая Варвара стоит на коленях, ее лицо обращено к зрителю и вниз, к двум озорным херувимам, смотрящим снизу вверх.
Во времена Рафаэля такие композиции, стилизованные во многом под сценические декорации, где центральные персонажи были обрамлены драпировкой или другими разграничивающими элементами, были обычным явлением для гробниц богатых людей, представляя собой торжественный вход после смерти на небеса. Эта Мадонна, предположительно созданная по образцу возлюбленной художника Маргерити Лутти, создает эффект классического благородства, хотя и приданный женщине, имеющей историческое религиозное значение. Она представляет не только божественную мать, но и прекрасную серьезность и легкость вселенской концепции матери.
Новаторством Рафаэля к традиционному сюжету стало добавление легких, остроумных человеческих элементов, особенно заметных в херувимах внизу по центру. Как маленькие мальчики, неугомонные в ожидании, тот, что справа, почти закатывает глаза, в то время как тот, что слева, подперев подбородок рукой, смотрит в пространство, как будто скучает в церкви. Они добавляют милый и озорной элемент реальности, который делает другие фигуры более убедительными и создает основу для картины как союза неземной духовности и эмоциональной человечности. Нотку реалистичности обычного человеческого поведения также можно увидеть в том, что папа римский снимает митру, помещенную в левом нижнем углу холста, подобно мужчине, снимающему шляпу в честь Пресвятой Девы. Как писала искусствовед Бетт Талваккиа, "Его искусство никогда не перестает поражать воображение зрителя, будь то завораживающая, грациозная красота его Мадонн, совершенство его классицистических форм или непреодолимая притягательность его повествовательных сцен".
Эта картина приобрела огромное влияние после того, как в 1754 году ее перевезли в Дрезден, Германия, где она приобрела особое значение для работ Иоганна Иоахима Винкельмана, пионера изучения истории искусств, который увидел в ней своего рода видение, объединяющее классические и христианские элементы. В Германии сложилась легенда о том, что Рафаэль написал ее, руководствуясь религиозным видением, и широко распространено мнение, что эта работа обладает чудодейственной силой. Историк искусства Гомбрих написал о Рафаэле, что его "лучшие работы дают нам возможность заглянуть в мир, более безмятежный и гармоничный, чем наш собственный".
Легенда о Рафаэле и вдохновляющий характер работы легли в основу романтического движения и оказали большое влияние на немецкого писателя и ученого Гете, музыканта Вагнера и философа Ницше. Великий русский романист Достоевский назвал это "величайшим откровением человеческого духа", тем самым перекликаясь с тем, что Вазари сказал об этой работе в 1500-х годах: "поистине редкое и экстраординарное произведение". Рафаэль также оказал влияние на современных художников, таких как Пабло Пикассо, который сказал: "Леонардо да Винчи обещает нам рай". Рафаэль дарит это нам ". Изображение херувима само по себе имело широкое распространение в популярной культуре, будучи изображенным на современных открытках, марках США, футболках и других потребительских товарах.