В предыдущей статье я написала для чего нужен гель-электрофорез, и что для этого нужно. Тут я сконцентрируюсь на том, как его ставить.
1) Во-первых, надо растопить агарозу. Для этого в банку помещается порошок агарозы, который заливается буфером TAE или TBE. Стандартно делают гель 1%, то есть 1г агарозы заливается 100мл буфера. Однако, если у вас мелкие фрагменты, которые быстро двигаются в геле, его можно сделать плотнее, 1.5% или 2%. Концентрация может быть даже больше. Плотность геля зависит от ваших задачи.
Гель топят в микроволновке, периодически перемешивая содержимое в банке. Если не перемешивать, то буфер может во время кипения вылиться из банки, и тогда вам придется начинать процедуру с начала. Нужно обязательно пользоваться прихваткой, чтобы не пролить буфер на себя.
Часто бывает так, что уже есть остатки геля от прошлых работ. В таком случае надо просто растопить эти остатки, обычно это быстрее, чем делать новый гель.
2) После того, как агароза растоплена, ее надо оставить остыть. Я обычно оставляю 100мг на 10-15 минут. Если у меня 50мг, то я оставляю на 7-10 минут. Тут важно, чтобы гель остыл примерно до 35-40С, но при этом там не должны сформироваться комки. Когда гель остыл, туда надо добавить краситель, самые распространенные - это бромистый этидий и SYBERGreen. Сколько их добавлять, опять зависит от количества вашей агарозы. На 100 мг я добавляю 1.5-2 мл бромистого этидия. Но это может зависеть также от концентрации красителя.
3) Пока агароза остывает, надо подготовить рамку с гребенками. То есть закрепить гребенки на рамке, чтобы могли сформироваться лунки.
После этого в рамку надо залить остывший гель с красителем из банки. Важно, чтобы лунки были достаточно глубокими, ДНК должна там задержаться. Но и слишком много геля тоже лить не стоит, потому что лишние расходы вовсе ни к чему. Следите за тем, чтобы не было пузырьков, особенно в районе лунок. Пузырьки могут привести к тому, что ДНК выльется из лунки или ее полоска не геле будет искажена.
4) Далее надо оставить гель затвердеть. Время зависит от толщины геля. Обычно это не менее 20 минут. Тут лучше подождать подольше, чем снять гребенки слишком рано. Если гель не успеет застыть, то лунки сомкнутся или поломаются, и у вас может получиться гель с дефектами или вовсе надо будет все переделывать.
5) После того, как гель затвердеет, можно вытащить гребенки. Гель будет выглядеть примерно вот так. Если у вас больше лунок, чем пробирок с ПЦР-продуктом, то гель можно порезать лезвием, и часть оставить на следующий раз. Гель можно хранить в холодильнике в пластиковом контейнере, залив буфером.
6) Гель с формочкой надо перенести в камеру для гель-электрофореза и полностью залить буфером ТAE или TBE, в данном случае буфер можно использовать несколько раз. Не забывайте, что черная сторона камеры - это минус, ток будет идти отсюда, поэтому лунки должны быть ориентированы в эту сторону.
7) Добавить маркер длин. Обычно добавляют 5 мкл в крайнюю правую или левую лунку.
8) В лунки надо залить ДНК. Для этого надо взять 3-5 мкл ПЦР-продукта, смешать его со специальным красителем (примерно 1 мкл) и занести эту смесь в лунку. Я смешивают на парафильме, но также есть специальные пластиковые планшеты для этих целей. Эту процедуру надо проделать со всеми пробирками с ПЦР-продуктом отдельно. ПЦР-продукт не надо смешивать с красителем, если для постановки ПЦР вы использовали мастер-микс, куда уже был добавлен краситель. Обычно такие смеси цветные - красные, оранжевые, желтые. В любом случае, надо прочитать заранее о реактивах, которые вы используете.
Если у вас много пробирок с ПЦР-продуктом, то у вас эта процедура займет какое-то время, минут 15-20, иногда полчаса. В таком случае ДНК из первых лунок будет постепенно вымываться. Не стоит пугаться, если содержимое в лунках побледнело. Обычно это не сказывается на результате (ДНК там все равно есть). Но если лунка выглядит совсем бледной, то имеет смысл добавить туда еще немного ДНК с красителем.
Еще одна тонкость. Те, у кого нет опыта в постановке геля-электрофореза, обычно пытаются поместить кончик носика как можно глубже в лунку и даже иногда втыкают его в гель. Это делать ни в коем случае нельзя. Если кончик носика попадет в гель, то в лунке ничего не останется.
9) После этого, камеру надо закрыть крышкой, подсоединить катод и анод к источнику питания (черный к черному отверстию, красный - к красному), и включить этот источник питания. Мощность будет зависеть от ваших целей. Обычно это 70-100 В. Если у вас длина фрагмента 500-800 пар нуклеотидов, то 20-25 минут будет достаточно. Если фрагменты меньше или длиннее, то надо изменить либо мощность, либо время.
10) После того, как прошло нужное время, надо выключить источник тока, снять крышку. В перчатках взять гель из рамки и перенести в трансиллюминатор. Тут дальнейшие действия будут зависеть от того, какой именно у вас прибор. В итоге вы должны увидеть ваш гель под ультрафиолетом, и если все прошло удачно, вы увидите полоски, которые соответствуют вашим фрагментам ДНК в каждой лунке, примерно как на этом изображении. Здесь в крайней левой лунке - маркер длин.
В следующей статье я напишу про то, какие технические проблемы могут возникнуть при постановке геля-электрофореза и основные ошибки.