Аномалии, влияющие либо на количество, либо на структуру хромосом, являются одними из основных причин неблагоприятных исходов в репродукции человека, начиная от бесплодия, неудачами имплантации и потерей беременности и заканчивая врожденными пороками и детской смертностью.
ЭКО в сочетании с PGT-A помогает выявить хромосомные аномалии, позволяя отобрать для переноса эмбрионы, которые не имеют числовых и структурных отклонений, что повышает эффективность ЭКО. Этот подход применяется в ВРТ уже более трех десятилетий, и внедрение PGT-A значительно расширяется, применяясь примерно в половине всех циклов ЭКО, проводимых в США.
Недавно были разработаны методы PGT-A, основанные на секвенировании следующего поколения (ngs) для оценки 24 хромосом за один рабочий процесс. Стандартные подходы к идентификации анеуплоидии на основе ngs основаны на анализе всего генома, собранных с помощью биопсии бластоцисты. Анеуплоидии выявляются путем выполнения анализа числа копий, который подсчитывает выровненные чтения ngs на каждой хромосоме, нормализует их по всем хромосомам и сравнивает их относительные различия внутри выборки.
Несмотря на свою техническую надежность, PGT-A на основе ngs имеет некоторые ограничения, такие как неспособность обнаружить числовые аномалии, затрагивающие весь набор хромосом (т.е. общегеномную плоидность). Когда на все хромосомы влияет одно и то же ненормальное значение числа копий, эффективный процесс нормализации считываний ngs делает практически невозможным определение абсолютного числа и набора хромосом. В результате однородно гаплоидные (т.е. 23 хромосомы) или триплоидные (т.е. 69 хромосом) эмбрионы могут быть ошибочно классифицированы как диплоидные (т.е. 46 хромосом). Аналогичным образом, стандартная морфологическая оценка числа пронуклеусов несовершенно связана со статусом плоидности. Хотя 2pn-зиготы интерпретируются как диплоидные, а зиготы с числом pn, отличным от 2, как плоидно-аномальные. Различные исследования показали, что около 1% 2pn-зигот дают эмбрионы с
аномальная плоидность, в то время как 50% эмбрионов 1pn и 10% эмбрионов, полученных из 3pn, подтверждены как нормальные диплоиды. Примечательно, что аномалия плоидности связана с отрицательными исходами беременности, включая неудачу имплантации, выкидыш и пузырный занос. В частности, триплоидная конфигурация обнаруживается более чем в 10% цитогенетически аномальных выкидышей. Следовательно, оценка эмбрионов с помощью более всеобъемлющей молекулярной методологии, способной различать различную плоидность(например, генотипирование по snp-массиву, гаплотипирование/генотипирование путем секвенирования) имеет потенциал увеличения: количество переносимых эмбрионов, в конечном счете улучшающих клинический исход, наблюдаемый у пар с бесплодием.
Еще одно ограничение современного ПГТ заключается в невозможности обнаружения делеций/дубликатов, имеющих клиническое значение, которые связаны с геномными синдромами, вызванными патогенными микроделециями (md).
Мd - это небольшие делеции, охватывающие несколько смежных генов в хромосоме. Синдромы md обусловлены гаплоиндуцированностью тех генов, которые расположены в удаленном гене, и могут приводить к особенно тяжелым заболеваниям, часто характеризующимся нарушениями развития и неврологическими отклонениями с врожденными аномалиями. Важно отметить, что общая частота апоптоза плода, ассоциированного с синдромами md, составляет 0,4% и остается одним из наиболее распространенных показаний для углубленной пренатальной диагностики, даже после переноса эуплоидного эмбриона в циклах ЭКО. Важно отметить, что возможность более раннего выявления md при предимплантации позволила бы проводить более точную классификацию жизнеспособных эмбрионов.
Чтобы преодолеть технические ограничения, исследователи стремились разработать и апробировать параллельную целевую стратегию ngs, которая позволяет интегрировать информацию о генотипе и анализ количества копий на основе данных о покрытии. Эта новая стратегия включает в себя плоидную и общепатогенную оценку md в рамках стандартного рабочего процесса PGT-A и значительно расширяет его диагностические возможности и клиническую полезность, создавая возможность глубже понять частоту возникновения md и ее последствия на предимплантационных стадиях развития.
Ретроспективный когортный анализ, включающий биопсию бластоцист, собранные в период с февраля 2018 по ноябрь 2021 года в нескольких клиниках ЭКО у потенциальных родителей европейского происхождения в возрасте до 45 лет, использующих аутологичные гаметы и прошедших ИКСИ для всех яйцеклеток. Определение уровня плоидности было подтверждено с использованием 164 образцов эмбрионов с известным статусом плоидности (147 диплоидов, 9 триплоидов и 8 гаплоидов). Для выявления 9 распространенных синдромов md был разработан и протестирован метод с использованием 28 положительных контролей и 97 отрицательных контролей. Позже методология была слепо применена при анализе 100 бластоцист, полученных из двух пронуклеусов (2pn), которые ранее были определены как равномерно эуплоидные по стандарту PGT-A.
Данные секвенирования были проанализированы с помощью вероятностной модели, которая оценивала вероятность уровня плоидности и присутствия md. Анализ поэтапных родительских гаплотипов, полученных с помощью генотипирования по однонуклеотидному полиморфизму, подтвердил наличие md.
Основные результаты:
✅на этапе аналитической валидации эта стратегия показала чрезвычайно высокую точность как в классификации по плоидности (100%, cl: 98,1-100%), так и при выявлении шести из восьми md (99,2%, ди: 98,5-99,8%).
✅Один случай триплоидии был обнаружен среди бластоцист, полученных из 2pn, и один патогенный md, ретроспективно идентифицированный среди образцов биопсии перенесенных эмбрионов, что привело к выкидышу. В последнем случае семейный анализ выявил тот же md в эмбрионах разных братьев и сестер от родителей, не являющихся носителями, что указывает на наличие мозаицизма зародышевой линии у женщины.
✅При отборе эмбрионов для переноса на основе их строения, эта стратегия позволяет идентифицировать эмбрионы с аномалиями плоидности и/или md, выходящими за рамки анеуплоидии с предполагаемой частотой 1,5% (n 3/202, 95% ди: 0,5-4,5%) среди эуплоидных эмбрионов.
✅В будущем потребуются эпидемиологические исследования для точной оценки частоты изменений плоидности и md у предимплантационных эмбрионов и особенно при эуплоидных выкидышах. Несмотря на высокую точность разработанного анализа, использование диагностических тестов с поддержкой родительской ДНК может еще больше повысить точность анализа.
✅Этот новый анализ значительно расширяет клиническую применимость PGT-A, объединяя наиболее распространенные патогенные md (оба унаследованы de novo), ответственные за геномные нарушения, которые обычно оцениваются на более поздней стадии с помощью инвазивного пренатального тестирования.
✅C точки зрения фундаментальных исследований, этот подход поможет прояснить фундаментальные биологические и клинические вопросы, связанные с генетикой неудачной имплантации и потерей беременности у эуплоидных эмбрионов.
В заключение: обнаружение хромосомной анеуплоидии может сопровождаться определением статуса плоидности и анализом md в рамках стандартного рабочего процесса PGT-A для получения более полного обзора геномного состава эмбриона. Внедрение этого комплексного подхода к PGT-A сопряжено с умеренными дополнительными затратами или рабочей нагрузкой для генетической лаборатории, особенно учитывая экономическую эффективность ngs и потенциальный прирост получаемой генетической информации.
Этот комплексный подход может быть использован для расширения диагностических возможностей ПГТ за счет включения состояний, не выявляемых с помощью стандартных методик, дальнейшего изучения фундаментальных биологических вопросов и повышения общей клинической полезности предимплантационного генетического тестирования для бесплодных пар.