Когда я сама училась ставить ПЦР, я помню, что мне не сразу стало понятно, зачем нужно обязательно ставить этот гель. Вроде как ПЦР реакция уже прошла, мы знаем, что праймеры работают для нашей группы. Почему нужно тратить время и расходники на эту довольно грязную процедуру каждый раз?
На самом деле, это очень важный этап в работе по изучению отдельных генетических маркеров, и им нельзя пренебрегать. Иначе ваши результаты могут быть очень сомнительными. Без оценки реакции ПЦР на геле, вы можете не сразу понять, что у вас что-то работает неправильно. И может случиться так, что в последствии вам придется потратить больше ресурсов, на то, чтобы все переделать.
Как работает гель-электрофорез? Вот тут очень понятно и подробно описан механизм. Я сделаю упор на практический аспект.
Для постановки геля-электрофореза вам понадобятся:
1. Камера для гель-электрофореза. Самые обычные - горизонтальные. Они все выглядят примерно одинаково - ванночка, к которой с двух сторон прикреплены электроды. Это несложная вещь, и неважно, кто ее производитель. Главное, чтобы ее электроды подходили к источнику постоянного тока, к которому она подключается.
2. Гелевая рамка, в которую вы будете заливать гель, чтобы он застыл. Она продается вместе с камерой, потому что должна делать гель, который подходит по размеру с ванночкой.
3. Гребенки, которые делают лунки в геле. Они также продаются в комплекте с ванночкой и гелевой рамкой, поскольку гребенки должны четко совпадать по ширине с рамкой. Обычно бывают гребенки с зубцами разного размера. Могут понадобится разные, в зависимости от ваших целей и навыков. Также желательно иметь пару комплектов ванночек, рамок и гребенок - большую и маленькую. В большой можно будет поставить гель на большое количество проб, это ускорит процесс. Можно будет всего один раз залить гель и поставить электрофорез на пару сотен проб одновременно. Однако если проб мало, то лучше использовать комплект меньших размеров, чтобы минимизировать расход агарозы, а она относительно дорогая.
Вот так выглядит рамка с гребенками.
Весь комплект может выглядеть примерно так.
4. Источник постоянного тока.
Выглядят все эти машиинки примерно одинаково. Если посмотрите на камеру для геля, то увидите, что у нее два шнура - черный и красный. В источнике тока отверстия окрашены в такие же цвета. Цвет отверстия и шнуры должны совпадать. У камеры на рисунке четыре пары отверстий, значит, к ней одновременно можно подключить 4 камеры.
В таких источниках питания можно выставить разное напряжение. Обычно это примерно 100В, при таком напряжении примерное время процесса электрофореза 20-25 минут. Но время зависит от длины ваших фрагментов и длины пространства между рядами лунок. Если оно большое, то гель можно оставить на более длительное время. Также если у вас длинные фрагменты, то их также лучше оставить на большее время. Чем ниже напряжение, тем больше времени надо для электрофореза. Не рекомендуют использовать напряжение более 120В, иначе гель может расплавиться. В любом случае стоит понаблюдать за работой вашего конкретного электрофоретического оборудования, чтобы найти оптимальное время и напряжение для вашей работы.
5. Агароза. Ее можно купить в тех организациях, которые продают реактивы, расходники и оборудование для молекулярной работы. Это белый порошок, но если его расплавить и он застынет, то станет прозрачным гелем. Для того, чтобы плавить агарозу, надо купить стеклянные банки с крышками. В целом, все равно какие, но лучше всего с рисками, обозначающие объем.
6. Микроволновка, в которой можно расплавить агарозу. Эта микроволновка может быть самой обычный, но если вы ее используете для работы с гелем, ее нельзя использовать для еды. Лучше что-бы микроволновка стояла прямо там, где вы занимаетесь гелем.
7. Весы, чтобы отмерять нужное количество агарозы. Обычно делают 1% раствор, это 1г на 100 мл. Но если у вас короткие фрагменты и они будут быстрее передвигаться в геле, то можно сделать гель плотнее, 1.5-2%.
8. Буфер TBA или TAE. Ими надо разбавлять агарозу. В интернете много рецептов как их делать. Например, вот рецепт для TBA, а вот рецепт для TAE. Их также можно купить готовыми. В стандартных случаях, для фрагментов 400-800 и то, и другое подойдет. Однако TBE лучше подходит для коротких фрагментов, и, в отличие от TAE, туда не надо добавлять сильных кислот, которые также могут считаться прекурсорами (а это отдельная проблема).
9. Краситель для агарозы. Его добавляют в агарозу, после того, как агарозу расплавили и она остыла, но еще не застыла (~50-60С). Самые обычные красители - бромистый этидий и SYBR Green. Их надо добавлять совсем чуть-чуть. Например, я добавляю примерно 1.5-1.8 мкл бромистого этидия на 100мл геля. Считается, что SYBR Green безопаснее бромистого этидия, так как у бромистого этидия были зарегистрированы канцерогенные свойства. Однако надо помнить, что все эти красители по определению связываются с ДНК. Так что работать с ними надо только в перчатках и халате.
10. Краситель для ДНК (DNA Loading dye). Также можно купить в тех организациях, которые продают реактивы и оборудование. Обычно он синий. Стандартно надо взять каплю вашего пцр-продукта, примерно 5 мкл, и смешать с 1 мкл этого красителя. Можно брать даже меньше красителя. Смешивать можно на парафильме или в специальных плашках с лунками, смотря что проще достать. Потом эту смесь надо с помощью дозатора перенести в лунку в геле.
11. Линейка или маркер длин ДНК (DNA Ladder). Содержит разные фрагменты ДНК, по которым можно измерить длину ДНК вашего ПЦР продукта. К ней всегда прилагается схема того, как располагаются содержащиеся в ней фрагменты на геле и длина каждого.
Иногда краситель и маркер длин продаются в комплекте.
12. Ультрафиолетовый трансиллюминатор, чтобы посмотреть, что получилось на геле. Красители связываются с ДНК, и светятся в ультрафиолете. Поместив гель в трансиллюминатор, можно увидеть, есть ли у вас продукт и оценить его длину. Трансиллюминаторов много разных от разных производителей, они также сильно отличаются по цене.
Могут быть просто вот такими коробками, в которых видно гель и полоски на нем при включении ультрафиолета.
Если есть возможность, то лучше купить трансиллюминатор, который в норме полностью скрывает ультрафиолет. В нем должна быть камера, которую можно подключить к компьютеру. Таким образом, вы изолируете себя от воздействия ультрафиолета и получите возможность делать быстро фотографии хорошего качества и сохранять их на компьютере. Что-то вроде такой системы.
13. Дозатор. Самый ходовой тут на 1-10 мкл, потому что обычно надо капать по 5 мкл ДНК и 1 мкл красителя. Подходящие наконечники для него. Дозатор, который используется для постановки геля-электрофореза, лучше использовать только для этих целей, потому что он будет контаминирован красителями.
14. Вся работа должна проводиться в перчатках. Для постановки геля необязательно брать чистые перчатки. Можно сохранять перчатки с этапа выделения ДНК и постановки ПЦР, где их нужно менять почаще, и использовать их для пост-пцр работ.
Постановка геля-электрофореза - это грязная процедура и может быть опасной, если не соблюдается техника безопасности. В идеале для нее должно быть выделено отдельное помещение. Если же нет такой возможности, все расходные материалы, оборудование, штативы для этого этапа должны храниться на отдельном столе, откуда ничего не должно переноситься на другие поверхности. Все перчатки после работы с гелем нужно сразу же выкидывать. Если какие-то штативы все же надо перенести, то их следует тщательно помыть.
В следующий раз я напишу подробно о том, как ставить гель-электрофорез и какие проблемы могут возникать во время этого процесса.