Абстрактный
Хотя уже давно признано, что гены играют решающую роль в определении риска распространенных нарушений развития, специфические транскрипты, способствующие развитию расстройств аутистического спектра (РАС), довольно сложно охарактеризовать. Тем не менее, недавние открытия теперь дают первое представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе этих синдромов, и начали проливать свет на аллельную архитектуру РАС. В этой статье мы обращаемся к тому, что известно об относительном вкладе различных типов генетической изменчивости в РАС, рассматриваем препятствия, стоящие перед открытием генов при этом сложном расстройстве, и оцениваем общие методологии, используемые для решения этих проблем, включая сцепление, молекулярные и матричные методы. основанная на цитогенетике и стратегиях ассоциации. Мы просматриваем текущую литературу, выделяя недавние открытия, касающиеся как редких мутаций, так и распространенных генетических полиморфизмов в этиологии аутизма. Наконец, мы описываем ключевые достижения в области геномных технологий, которые трансформируют все области генетики человека, и рассматриваем как возможности, так и проблемы для исследований аутизма, связанные с этими быстрыми изменениями.
Уже более десяти лет генетические исследования играют ведущую роль в исследованиях аутизма. Этот акцент был обусловлен как очень убедительными доказательствами того, что гены несут львиную долю риска общих нарушений развития [Bailey et al., 1995, обзор Rutter et al., 1999], так и ожиданием того, что открытие этиологических механизмов приведет к прогрессу в диагностике, лучшему пониманию естественной истории и развитию новых способов профилактики и лечения.
Хотя обоснование акцента на ДНК вполне оправдано, а цели работы похвальны, справедливо будет сказать, что достижения в области открытия генов — это не все, на что могли надеяться ученые, пациенты или члены их семей. . Путь был долгим, трудным и временами крайне разочаровывающим, характеризовался дразнящими выводами, которые было трудно подтвердить, и неуклонно растущим числом испытуемых, которые потребуются для выяснения основных генетических рисков.
Однако даже самый скептически настроенный наблюдатель не может не с оптимизмом смотреть в будущее этой области исследований. Этот яркий взгляд, несмотря на, по общему признанию, неоднозначное прошлое, является результатом нескольких ключевых недавних достижений: во-первых, за последние несколько лет появилось все более тонкое представление о генетической архитектуре расстройств аутистического спектра; во-вторых, наконец-то появились инструменты, необходимые для выявления общих генетических рисков с малым эффектом в сложных медицинских условиях [Saxena et al., 2007; Скотт и др., 2007 г.; Консорциум по управлению делами Wellcome Trust, 2007 г.; Зеггини и др., 2007]; в-третьих, технология выявления редкой генетической изменчивости стала заметно мощнее и находится на пороге того же типа трансформации, который был характерен для поиска общей генетической изменчивости; и, наконец, в сообществе аутистов партнерство между пациентами, родителями и семьями, исследователями, филантропами и федеральным правительством создало исследовательскую среду, весьма способствующую прогрессу.
В последующем обсуждении будут рассмотрены эти конвергентные разработки, описаны различные методы и подходы, используемые в настоящее время для идентификации генов аутизма, и освещены совсем недавние результаты. Он также решит текущие проблемы в этой области, в том числе настоятельную необходимость способствовать еще большему участию пациентов и их семей в исследованиях генетики аутизма, чтобы разработать размеры выборки, необходимые для полного выяснения вклада как редких, так и распространенных генетических вариантов в РАС.
Генетические основы аутизма
Аутизм считается наиболее генетическим из всех психоневрологических синдромов, связанных с развитием. Риск среди братьев и сестер пораженных лиц оценивается в 2-8% [обзор Rutter et al., 1999], или примерно в 20-80 раз выше, чем среди населения в целом [Fombonne, 2005]. Аналогичное увеличение риска внутри семей наблюдается и для более широкого спектра [Bolton et al., 1994]. Более того, исследования близнецов предполагают, что такое скопление внутри семьи лучше всего объясняется общими генами, а не общим окружением [Bailey et al., 1995].
Эти результаты дают убедительные доказательства вклада генетических факторов. Однако они заходят так далеко лишь в прояснении природы этого риска. Остаются важные вопросы: среди них вопрос о том, сколько генов может быть вовлечено либо в пределах одного человека, либо в популяции, являются ли генетические вариации, способствующие риску, обычными или редкими в популяции, и какая доля риска передается от поколения к поколению, по сравнению с тем, что появляется вновь (de novo) у пострадавшего человека. Эти вопросы очень важны, поскольку генетическая архитектура расстройств аутистического спектра (РАС) оказывает огромное влияние на потенциал успеха различных подходов к открытию генов. К счастью, недавние данные самых разных исследований начали проливать некоторый свет на эти вопросы.
Генетическая архитектура РАС
В течение последнего десятилетия крупномасштабные генетические исследования фактически исключили возможность того, что один ген сильного влияния будет отвечать за значительную часть РАС [обзор Gupta and State, 2007]. Более того, усилия по открытию генов уже идентифицировали множественные отдельные редкие изменения в генетическом коде у небольших групп людей, которые вызывают аутизм или способствуют ему. Короче говоря, аутизм — это генетически гетерогенное заболевание с множеством различных вариаций последовательности и структуры ДНК, которые могут способствовать сходным клиническим проявлениям.
Хотя наличие более чем одного гена РАС общепризнано, нет четкого консенсуса относительно того, насколько гетерогенным может быть синдром, то есть сколько генов или локусов может вносить свой вклад либо в пределах одного человека, либо среди всей группы затронутых лица. Кроме того, важно различать гетерогенность локуса, которая относится к вариациям во многих различных генах или областях ДНК (локусах), приводящих к сходному фенотипу, и аллельную гетерогенность, которая относится к различным вариациям или мутациям в одном и том же локусе, приводящим к идентичная или перекрывающаяся клиническая картина. На сегодняшний день накопленные данные свидетельствуют о том, что оба, вероятно, играют роль в РАС, и каждый из них создает определенные проблемы для открытия генов, как подробно описано ниже.
Другой особенно важный вопрос, касающийся генетической архитектуры РАС, заключается в том, являются ли соответствующие генетические вариации более распространенными или редкими в популяции. На первый взгляд это может показаться простым вопросом: поскольку РАС представляет собой группу распространенных расстройств (от 0,1 до 0,67% людей), можно сделать вывод, что должны действовать общие, способствующие генетические факторы, часто называемые Гипотеза общего варианта болезни. Действительно, есть несколько линий доказательств, предполагающих, что значительная часть РАС может быть результатом заговора общих аллелей риска внутри человека, обычно в сочетании с влиянием окружающей среды, что приводит к фенотипу. Например, семейные исследования показали, что риск РАС среди родственников резко снижается по мере того, как человек удаляется с точки зрения семейных отношений от больного пробанда, что согласуется с множественными общими аллелями, сходящимися у пораженного потомства. Более того, наличие малозаметных субклинических симптомов у родственников пораженных лиц давно признано и недавно получило значительное экспериментальное подтверждение [Constantino et al., 2006], предполагая, что можно наблюдать экспрессию некоторой части, но не полный набор аллелей риска среди этих родственников.
В самом деле, как правило, до недавнего времени область психиатрической генетики была в значительной степени занята представлением о том, что общие сложные расстройства являются результатом действия и взаимодействия множества общих генетических вариаций (или аллелей). Однако недавние данные свидетельствуют о том, что это не предрешенный вывод ни в отношении аутизма, ни в отношении других распространенных психических синдромов [McClellan et al., 2007].
Одним из основных факторов, определяющих частоту любой данной генетической изменчивости в популяции, является естественный отбор. Если в последовательность человеческого генома вносится вредное изменение, ведущее к снижению приспособленности в дарвиновском смысле, маловероятно, что оно со временем будет процветать в популяции или возрастет до заметной частоты аллелей. Кроме того, если заболевание возникает в результате частых мутаций de novo в одном или нескольких локусах, каждая из вариаций, вероятно, будет редкой, поскольку вероятность ее распространения в популяции будет снижена. Гипотеза редкого варианта общего заболевания утверждает, что, если вариации в достаточном количестве локусов могут привести к сходному фенотипу, накопление индивидуально редких изменений может составлять значительную часть риска общего заболевания.
В самом деле, в некоторых смыслах РАС может показаться первым кандидатом в модель редкого варианта распространенного заболевания: оно начинается в раннем возрасте, может резко ухудшить взаимные социальные взаимодействия и часто связано с умственной отсталостью (ЗУ), которая также может влиять на репродуктивную способность. Кроме того, как повышенный риск аутизма, выявленный у пожилых отцов [Reichenberg et al., 2006], так и наблюдаемая большая разница между монозиготными и дизиготными уровнями конкордантности согласуются со значительным вкладом мутации de novo. Наконец, как будет более подробно обсуждаться ниже, в этиологию РАС уже вовлечены редкие вариации последовательностей, такие как редкое субмикроскопическое увеличение или потеря хромосомного материала de novo [Sebat et al., 2007].
Вопрос об относительном вкладе распространенных и редких вариантов в РАС — это не просто академическая дискуссия. В настоящее время это является ключевым фактором при разработке, проведении и интерпретации усилий по открытию генов; например, ведущие подходы к выявлению распространенных генетических рисков не позволяют выявить редкие мутации. В качестве альтернативы, исследования редких вариантов последовательностей намного дороже, чем исследования распространенных вариантов, и, следовательно, в настоящее время имеют практические ограничения, особенно в отношении их объема.
Кроме того, стратегии набора семей могут иметь важное влияние на тип вариации, который лучше всего удается идентифицировать. Недавние исследования подтверждают гипотезу о том, что простые семьи с большей вероятностью выявляют мутации de novo [Sebat et al., 2007], тогда как мультиплексные семьи, вероятно, выявляют передаваемые варианты [Bakkaloglu et al., 2008]. Также вероятно, что семьи, рекрутированные в пределах генетических изолятов и в регионах, где распространено кровное родство, будут особенно ценны для картирования рецессивных аллелей и редких мутаций-основателей [Strauss et al., 2006]. Ограничение набора, например, людьми с более высокими коэффициентами интеллекта и отсутствием судорог или дисморфологии, вероятно, уменьшит количество de novo и редких хромосомных аномалий, обнаруженных в этой выборке, тогда как противоположная стратегия, вероятно, обогатит эти типы вариантов.
Короче говоря, как методология, так и характер стратегий набора, используемых в исследованиях аутизма, потенциально могут повлиять на то, что будет обнаружено. Эта реальность подчеркивает, что перед интерпретацией результатов отдельного исследования или группы исследований необходимо внимательно изучить характер исследуемой выборки и используемые методы. Что касается аутизма, то наличие нескольких крупных общедоступных репозиториев ДНК не только резко увеличило темпы генетических исследований, но также привело к множественным исследованиям одной и той же популяции (групп), которые привносят в них внутренние предубеждения, обусловленные характером конкретного набора. стратегии.
Несколько дополнительных наблюдений, касающихся передачи РАС, могут оказаться очень важными для открытия генов. Например, аутизм поражает мужчин в четыре раза чаще, чем женщин [обзор Fombonne, 2005]. Причина этого различия не совсем понятна, но на первый взгляд предполагает возможную роль половых хромосом в этиологии РАС. Хотя исследования не выявили общих генетических вариаций с большим влиянием на Х-хромосому, весьма правдоподобен вклад множественных отдельных Х-сцепленных мутаций или общих вариаций с небольшими эффектами. Тем не менее, важно подчеркнуть, что преобладание мужского пола само по себе не обязательно указывает на фактор риска, сцепленный с Х-хромосомой. Действительно, существует множество примеров заболеваний с гендерной предвзятостью в распространенности, возникающих в результате известных мутаций или аллелей риска, картированных аутосомам [Fontaine et al., 1994; Гарави и др., 2000; Moirand et al., 1997], и существуют четкие различия в экспрессии мужских и женских генов аутосомных транскриптов в головном мозге, которые широко наблюдались на модельных организмах [Yang et al., 2006]. Конечно, существуют также значительные гормональные влияния на внутриутробную среду, которые различаются у мужчин и женщин, что влияет на экспрессию генов и развитие мозга, что может привести к различному соотношению полов при РАС [Knickmeyer and Baron-Cohen, 2006].
Наконец, важно отметить, что фенотипическая гетерогенность может быть не менее сложной задачей для открытия генов, чем ее генетическая противоположность. Что касается РАС, уже имеются убедительные доказательства того, что одна мутация в одном гене может привести к разнообразным клиническим проявлениям, которые не подчиняются современным диагностическим границам [Jamain et al., 2003; Ломонье и др., 2004]. Это не должно быть полной неожиданностью. Данные исследований близнецов уже давно показали, что люди, у которых полностью совпадает ДНК, с большой вероятностью также имеют общие признаки социальной инвалидности, но значительная их часть не будет затронута в равной степени или даже не попадет в одну и ту же диагностическую категорию [Bailey et al., 1995]. . Кроме того, уже имеется множество примеров, когда вариабельная экспрессия одной генетической аномалии может в одних случаях приводить к РАС, тогда как в других — к МР без каких-либо признаков задержки социального развития или крайне ограниченного или стереотипного поведения [Laumonnier et al. , 2004]. Фактически, самые недавние исследования выявили перспективу того, что широта фенотипических проявлений некоторых локусов аутизма может включать то, что обычно считается совершенно разными психиатрическими диагностическими категориями [Weiss et al., 2008].
Таким образом, текущие данные указывают на неопределенность, связанную с фенотипической гетерогенностью, вероятным участием как аллельной, так и локусной гетерогенности, потенциальным вкладом как редких, так и распространенных аллелей в повышение риска заболевания, а также наличием локусов риска (или защитных) как на половые хромосомы и аутосомы. Ниже описаны инструменты, которыми в настоящее время располагают генетики, результаты недавних экспериментальных усилий и потенциальный вклад развивающихся технологий в решение этих проблем.
Стратегии идентификации генов и недавние открытия
В целом, усилия по открытию генов можно разделить на три общие методологические категории: те, которые используют стратегии сцепления, цитогенетики или ассоциации. Каждый подход имеет свои потенциальные преимущества и недостатки с точки зрения его способности обнаруживать различные типы генетической изменчивости и свои собственные особые проблемы в отношении связи этих вариаций с интересующим фенотипом. Хотя для этой статьи полезно классифицировать на основе этих широких подходов, также важно отметить, что эти подходы, вероятно, будут все больше сближаться, когда лаборатории будут использовать комбинацию стратегий, чтобы сузить круг специфических генов РАС и подтвердить их актуальность. Однако разработка методологий, представленных ниже, полезна для выявления взаимосвязи между природой изучаемой генетической изменчивости и особенностями используемых стратегий открытия генов.
Анализ связей
Генетическая связь прослеживает передачу хромосомных сегментов через поколения. Это наследование отслеживается с помощью генетических маркеров, которые представляют собой известные вариации последовательностей, которые можно легко проанализировать. Можно использовать несколько стратегий для проверки того, согласуется ли характер передачи таких маркеров с гипотезой о том, что интервал (локус), в котором они присутствуют, несет вызывающий заболевание аллель или аллель риска.
Когда общий образец наследования для конкретного расстройства может быть угадан, как это часто бывает в случае традиционных менделевских состояний, метод, известный как полногеномное параметрическое сцепление, оказался исключительно мощным инструментом для открытия генов. В этом подходе предлагается гипотеза о специфике передачи аллеля болезни, а затем генетические данные анализируются в нескольких поколениях в поисках маркеров, которые соответствуют модели наследования, предполагающей, что они расположены рядом (или связаны) с болезнью. место. Затем можно рассчитать вероятность наблюдения данных, учитывая предложенную модель передачи, по сравнению с вероятностью наблюдения данных просто из-за случайности, с результатами, традиционно выражаемыми как логарифм оценки шансов (LOD).
В литературе по аутизму сообщается об относительно небольшом числе исследований параметрической связи. Одна из причин этого заключается в том, что семьи с РАС как группа не предполагают участия одного или небольшого числа генов, что является условием, при котором параметрическое сцепление является наиболее сильным. Тем не менее, при использовании этого подхода были достигнуты некоторые заметные успехи, что позволяет предположить, что применение этой методологии к особым группам населения и необычным семьям остается плодотворной областью для исследований. Например, Laumonnier et al. [2004] изучили одну большую семью, пораженную как МР, так и РАС, идентифицировали статистически значимое сцепление с областью на Х-хромосоме, а затем обнаружили функциональную мутацию в нейролигине 4, сцепленном с Х-хромосомой (NLGN4X), что убедительно подтверждает более раннее открытие. предполагая роль NLGN4X в РАС [Jamain et al., 2003]. Кроме того, параметрический анализ сцепления имел решающее значение для определения области, содержащей ген синдрома Ретта, MECP2 [Curtis et al., 1993; Эллисон и др., 1992; Шанен и Франке, 1998 г.; Шанен и др., 1997; Уэбб и др., 1998 г.; Xiang et al., 1998], что прояснило генетическую основу подавляющего большинства случаев Ретта, а также привело к идентификации мутаций MECP2 в небольшом числе случаев аутизма [обзор Моретти и Зогби, 2006]. Совсем недавно редкая рецессивная мутация-основатель в Contactin-Associated Protein-Like 2 (CNTNAP2) у лиц с синдромом трудноизлечимой эпилепсии, MR и аутизмом [Strauss et al., 2006] была идентифицирована с использованием параметрического сцепления среди амишей старого порядка. Население. Роль этого гена в развитии идиопатического аутизма недавно была предложена тремя независимыми группами исследователей [Alarcon et al., 2008; Аркинг и др., 2008 г.; Bakkaloglu et al., 2008], подробно описанных в последующих разделах.
В случае, когда модель наследования неясна (или сложна), широко используются непараметрические или безмодельные подходы. Эти методы исследуют, отклоняется ли совместное использование маркеров между согласованными (пораженными) членами семьи или отсутствие совместного использования между несогласными членами семьи от случайно ожидаемого. Это приводит к подходу, который является более надежным в условиях неопределенности в отношении природы генетической передачи, но на практике менее эффективным в отношении идентификации генов конкретных заболеваний или аллелей риска.
Наиболее широко используемый тип этого анализа известен как Affected Sib-Pair, который исследует маркеры, общие для пораженных братьев и сестер. Следует отметить, что непараметрические исследования связи могут сообщать о связи в стандартной оценке LOD, Z-оценках (которые основаны на стандартных отклонениях от нормального распределения) или P-значениях. В настоящее время наиболее широко распространены следующие пороговые значения значимости: LOD>2,2, Z-показатель>3,2 или P<0,0007 принимаются как предполагаемое свидетельство сцепления, а это означает, что одно значение, превышающее этот порог, можно было бы ожидать случайно в каждое полногеномное сканирование. LOD>3,6, Z-score>4,1 или P<0,00002 считаются значимым сцеплением, что соответствует одному обнаружению случайно на 20 полногеномных сканирований [Lander and Kruglyak, 1995].
На сегодняшний день проведено более дюжины исследований непараметрического сцепления РАС по всему геному. Они подробно рассматриваются в других источниках [см., например, Veenstra-VanderWeele and Cook, 2004]. Почти каждая хромосома продемонстрировала некоторые доказательства в пользу сцепления, но ни одна область не была признана высоко значимой, и в этих областях не было обнаружено никаких генетических вариаций или мутаций, которые полностью объясняли бы статистические данные. Самое последнее сканирование, проведенное Консорциумом проекта генома аутизма [2007], включало 1181 мультиплексную семью и 10 000 маркеров, с мощностью 80% для определения LOD 3 балла (как уже отмечалось, порог между наводящим на размышления и значимым сцеплением) и специфичными для локуса рисками. выше 1,29. В этом исследовании были обнаружены наиболее убедительные доказательства сцепления на хромосоме 11p12 (Z-показатель = 3,57). Кроме того, в нескольких исследованиях было показано предполагаемое или значимое сцепление с хромосомами 7 и 17 [Ashley-Koch et al., 1999; Барретт и др., 1999; ИМГСАК, 1998, 2001; Моллой и др., 2005 г.; Philippe et al., 1999], регионы, в которых в настоящее время ведутся интенсивные исследования в поисках аллелей, способствующих риску.
Учитывая большое количество анализов и субанализов непараметрических данных, а также широкое обсуждение в литературе, этот обзор будет сосредоточен на общих выводах, которые можно сделать из этого объема работы: во-первых, отсутствие более поразительных результатов из самого большого из недавних сканирований предполагает, что общие аллели, способствующие РАС, вероятно, несут очень небольшой риск. Это важное наблюдение, поскольку оно предполагает, что альтернативные подходы, такие как полногеномная ассоциация, которые особенно хорошо подходят для этого типа изменчивости, могут быть весьма ценными. Важно отметить, что непараметрические исследования сцепления способны выявлять редкие вариации, способствующие расстройству, даже при наличии выраженной аллельной гетерогенности. Однако эта стратегия быстро теряет силу перед лицом неоднородности локуса. Таким образом, если бы при РАС присутствовало небольшое количество генов с множественными аллелями болезни, текущие сканирования должны были бы их идентифицировать. К счастью, инструменты для успешной идентификации распространенных аллелей, несущих умеренный риск, теперь широко доступны, и возможность поиска в геноме множественных редких вариаций во многих генах почти готова.
Результаты непараметрического сканирования сцепления на сегодняшний день ясно подчеркивают проблемы, связанные с комбинацией генетической и фенотипической гетерогенности. Они также предполагают, что будет важно рассмотреть альтернативные стратегии, которые могли бы уменьшить эти путаницы. Несколько групп уже использовали методы, которые пытаются использовать так называемые эндофенотипы, чтобы уменьшить неоднородность выборки. Это наблюдаемые феномены, проходящие через биологический континуум от генотипа до категориального диагноза. Некоторые очень интересные результаты были получены, когда, например, показатели языкового развития рассматривались в качестве альтернативы стандартным диагностическим категориям при сканировании связей [Alarcon et al., 2002, 2005; Брэдфорд и др., 2001]. Кроме того, особенно интересный недавний набор экспериментов показал, что профили экспрессии крови могут различать людей с аутизмом на основе различных известных генетических мутаций [Nishimura et al., 2007], что повышает вероятность того, что эти типы данных могут привести к к выявлению более однородных групп пациентов и облегчению открытия генов. В конечном счете мерилом ценности любого из этих подходов будет идентификация и подтверждение генетической изменчивости, которая способствует возникновению этих признаков.
Цитогенетика
Уже давно известно, что хромосомные аномалии обнаруживаются у детей-аутистов гораздо чаще, чем в общей популяции. Сюй и др. [2004] недавно проанализировали большое количество зарегистрированных аномалий, а тщательно подобранная база данных доступна в Интернете (http://projects.tcag.ca/autism/). Дополнительные доказательства вклада хромосомных перестроек в РАС можно увидеть при идентификации цитогенетических аномалий, которые концентрируются в определенной области генома. Одно из самых убедительных открытий на сегодняшний день в этом отношении касается передающихся от матери дупликаций 15q11-13, которые могут быть обнаружены у 1-3% пациентов с диагнозом идиопатический аутизм [обзор Veenstra-VanderWeele and Cook, 2004].
Фактически, цитогенетические подходы предоставили первые доказательства наличия гена аутизма четыре десятилетия назад, когда Lubs [1969] описал хромосомную аномалию на длинном плече Х-хромосомы у четырех мужчин, страдающих МР, что дало первое описание хрупкого участка, связанного с МР. локус Fragile X Syndrome (FXS). За последнее десятилетие было хорошо охарактеризовано наличие аутизма среди лиц, несущих мутации ломкой Х-хромосомы: РАС может быть диагностирован у 30% мужчин с FXS, а мутации ломкой Х-хромосомы могут быть обнаружены у 7–8% лиц с FXS. идиопатический РАС [обзор Muhle et al., 2004].
Одним из потенциальных преимуществ изучения редких подгрупп пациентов является перспектива того, что в значительной степени моногенные формы распространенного заболевания могут открыть окно в биологию расстройства. В случае FXS особенно интересны недавние исследования гена болезни Fragile X умственной отсталости 1 (FMR1) [Kremer et al., 1991] и его белкового продукта, белка умственной отсталости Fragile X (FMRP): FMRP Известно, что он взаимодействует с несколькими транскриптами и подавляет трансляцию генов, способствует пластичности за счет участия в процессе долговременной депрессии в синапсе и помогает регулировать функцию метаботропных глутаматных рецепторов группы I (mGluR) [обзор Penagarikano et al. ., 2007]. Потеря FMRP приводит к увеличению сигнальной активности mGluR5 и неблагоприятно влияет на синаптическую пластичность. Эти недавние открытия привели к новым и неожиданным направлениям для вмешательства: в животных моделях FXS использование антагонистов глутаматных рецепторов (таких как 2-метил-6-(фенилэтинил)пиридин или литий) может спасти некоторые из фенотипических особенностей, возникающих в результате потеря экспрессии FRMP [McBride et al., 2005; Такер и др., 2006 г.; Ян и др., 2005b]. Столь же многообещающим может быть уменьшение экспрессии mGluR5 [Dolen et al., 2007]. Могут ли такие вмешательства иметь отношение только к пациентам с FXS, FXS с ASD или только ASD, еще предстоит ответить. Тем не менее, этот недавний прогресс выдвигает на первый план идеи, которые можно пролить на редкие генетические формы распространенных заболеваний.
Хотя картирование хромосомных аномалий для выявления локусов, вызывающих заболевание, или аллелей риска при аутизме является многообещающим подходом к открытию генов, этот метод также создает серьезные проблемы в отношении демонстрации причинно-следственной связи. Часто такие исследования начинаются с первоначального наблюдения редкой аберрации в хромосомной структуре больного человека или небольшого числа людей. Когда молекулярные методы демонстрируют, что такая аномалия нарушает структуру гена, экспрессируемого в мозге, возникает соблазн приписать фенотип этой перестройке. Однако важно помнить, что часто нет априорных статистических доказательств этой взаимосвязи. Более того, как будет более подробно обсуждаться ниже, становится все более очевидным, что геном часто способен переносить нарушение или даже потерю хромосомных сегментов без наблюдаемых последствий.
Проблема перехода от идентификации одной или небольшого числа хромосомных аномалий к демонстрации значимости определенного гена для РАС хорошо продемонстрирована в отношении недавних открытий, связанных с нейролигинами, семейством экспрессируемых в мозге транскриптов, участвующих в формировании синапсов. и функция [Lise and El-Husseini, 2006]. Первоначально сообщалось о нескольких случаях делеции небольшого сегмента Х-хромосомы среди пораженных самок [Thomas et al., 1999]. Джамейн и др. [2003] затем оценили последовательность гена в пределах этого интервала, NLGN4X, исследовав 158 субъектов с идиопатическим аутизмом и обнаружили усеченную мутацию у двух больных в одной семье. Это открытие убедительно свидетельствует о роли редких мутаций в NLGN4X в небольшом числе случаев РАС. Авторы также сообщили о миссенс-замене, приводящей к замене аминокислоты в высококонсервативной области NLGN3 (также Х-сцепленной). В этом случае изменение последовательности ДНК вызывало большие подозрения, но его влияние на функцию белка было менее очевидным, чем в случае NLGN4X.
Хотя эти первоначальные наблюдения были чрезвычайно интригующими, в первоначальном отчете не было достаточного количества цифр, чтобы подтвердить статистическую связь с расстройством. Кроме того, наличие высоко гомологичного гена на Y-хромосоме (NLGN4Y) повысило вероятность того, что, в отличие от многих Х-сцепленных мутаций, при которых только самки способны компенсировать крайне опасную мутацию (за счет того, что 50% их клеток экспрессируют нормальная копия из-за случайной инактивации X), в этом случае NLGN4Y может обеспечить аналогичную меру защиты для мужчин. Наконец, последующий скрининг относительно больших групп людей с аутизмом не смог продемонстрировать кодирующие мутации нейролигинов, явно способствующие РАС, хотя несколько редких вариантов миссенс были идентифицированы в NLGN4X [Blasi et al., 2006; Готье и др., 2005 г.; Винсент и др., 2004 г.; Ян и др., 2005а].
Несмотря на вопросы, поднятые этими наблюдениями, впоследствии было собрано несколько дополнительных доказательств, подтверждающих актуальность мутаций, особенно в NLGN4X, для РАС. Во-первых, как уже отмечалось, Laumonnier et al. [2004] выполнили анализ сцепления в родословной с MR и ASD, нашли убедительные статистические доказательства мутации на Х-хромосоме, а затем идентифицировали расщепляющую замену сдвига рамки считывания в NGLN4X у больных мужчин и женщин-носителей, представляющую мощную независимую репликацию.
Дополнительные исследования in vitro также подтвердили функциональный потенциал первоначально идентифицированных мутаций: Chih et al. [2004] продемонстрировали, что сверхэкспрессия NLGN3/4X в культивируемых нейронах гиппокампа приводит к образованию пресинаптических элементов и что эта активность теряется при введении мутаций, обнаруженных у пациентов с РАС. Было также обнаружено, что при повторении в клетках COS идентифицированные человеческие мутации приводят к потере NLGN4X и снижению уровня NLGN3 на клеточной поверхности, а также к сохранению обоих в эндоплазматическом ретикулуме [Chih et al., 2004; Чубыкин и др., 2005; Комолетти и др., 2004].
Более поздние результаты также предоставили доказательства того, что молекулы, взаимодействующие с нейролигинами, могут играть роль в этиологии РАС. В двух недавних сообщениях было обнаружено множество de novo и унаследованных мутаций в гене SH3 и доменах множественных анкириновых повторов 3 (SHANK3) у людей с РАС [Durand et al., 2007; Моесснер и др., 2007]. SHANK3, как полагают, организует постсинаптическую плотность [Baron et al., 2006] и, как известно, связывается с нейролигинами в двухгибридных системах дрожжей [Meyer et al., 2004]. Относительно высокая частота мутаций de novo с участием кодирующих сегментов SHANK3 у лиц с идиопатическим аутизмом, а также обнаружение задержки развития и аутистических признаков у пациентов с синдромом делеции 22q13 подтверждают актуальность этих результатов.
В нескольких недавних работах также подчеркивается потенциальная роль Neurexin 1 (NRXN1), партнера по транссинаптическому связыванию нейролигинов [Lise and El-Husseini, 2006]. В самом последнем сканировании сцепления, о котором сообщил Консорциум проекта генома аутизма [2007], был проведен анализ количества копий, хотя и с мощностью только для обнаружения крупномасштабных аномалий (зонды 10K). Была идентифицирована одна семья, в которой два пораженных брата и сестры имели одинаковую делецию 300 т.п.н., охватывающую кодирующие области NRXN1, которой не было у родителей. Эти результаты подчеркивают потенциальную значимость этого транскрипта для РАС и, в более общем плане, подчеркивают феномен мозаицизма зародышевой линии, при котором генетическая мутация присутствует только в некоторых клетках зародышевой линии родителя. Эта возможность является одной из нескольких причин, по которым мутации de novo могут быть исследованы как в мультиплексных, так и в симплексных семьях. При наличии таких редких случаев множественного потомства с одной и той же аномалией можно оценить конкордантность заболевания. Также недавно сообщалось о редких миссенс-вариантах и сбалансированных хромосомных аномалиях, нарушающих NRXN1 у пациентов с РАС [Feng et al., 2006; Ким и др., 2008]. В целом, эти данные предоставляют предварительные доказательства участия нейрексинов в РАС и, в более широком смысле, подтверждают гипотезу о том, что нарушение молекулярного пути, включающего NLGN, может иметь значение для патофизиологии РАС.
Похожая возможность появляется для вовлечения контактин-ассоциированного пути в РАС. Фернандес и др. [2004] охарактеризовали редкую хромосомную аномалию, нарушающую работу гена Contactin 4, нейронально экспрессируемой молекулы адгезии, у синдромального пациента с РАС. Последующая работа нескольких лабораторий, подробно описанная в других местах этой статьи, также недавно подтвердила роль вариаций в CNTNAP2, синаптическом связывающем партнере для молекул контактина, участвующих в миграции нейронов [Alarcon et al., 2008; Аркинг и др., 2008 г.; Баккалоглу и др., 2008 г.; Штраус и др., 2006]. Кроме того, наша лаборатория также выявила транслокацию de novo в контактин-ассоциированном белке 4 (CNTNAP4) у ребенка с задержкой развития и аномалиями миграции нейронов [M.W.S. и Б.Дж.О., личное сообщение]. Все эти данные предполагают, что эти взаимодействующие семейства молекул могут быть благодатной областью для дополнительных генетических и нейробиологических исследований.
Таким образом, выяснение значимости одного или небольшого числа наблюдений редких цитогенетических вариантов может занять время и потребовать междисциплинарных подходов. По самой своей природе эти события редки, и, следовательно, получение достаточного количества для установления однозначной статистической поддержки может быть проблематичным. Тем не менее, потенциальная польза от следования подсказкам из этих наблюдений уже появилась, и из этих открытий начали появляться дразнящие данные о потенциальных молекулярных путях, связанных с РАС.
Цитогенетика на основе массивов/анализ числа копий
Одно из самых интересных открытий последнего десятилетия было связано с недавно выявленной формой генетической изменчивости [Iafrate et al., 2004; Себат и др., 2004]. В попытке обнаружить ранее скрытые хромосомные аномалии у пациентов с раком и задержкой развития в начале этого века было разработано несколько подходов, в которых использовались микрочипы для исследования хромосомной структуры с высоким разрешением. Как и предполагалось, эти платформы смогли обнаружить делеции и дупликации, которые ранее были невидимы с помощью стандартных методов молекулярной цитогенетики. Вдобавок, однако, исследователи сделали удивительное открытие, что прирост и потеря хромосомного материала чрезвычайно распространены по всему геному среди явно типично развивающихся индивидуумов.
Возможность обнаруживать субмикроскопические делеции и дупликации хромосомного материала быстро привела к важным открытиям при РАС. Как уже отмечалось, идентификация ранее скрытой делеции в NRXN1 во время полногеномного сканирования [The Autism Genome Project Consortium, 2007] продемонстрировала потенциальную мощность обнаружения вариаций числа копий (CNV) на основе микрочипов. В ключевом недавно опубликованном исследовании [Sebat et al., 2007] для скрининга 195 семей с аутизмом и 196 контрольных семей использовалась методика конкурентной геномной гибридизации, известная как репрезентативный анализ олигонуклеотидных микрочипов. Изменения количества копий de novo присутствовали у 12 из 118 (10%) пациентов из однополых семей, у двух из 77 (2%) пациентов из мультиплексных семей и у двух из 196 (1%) пациентов из контрольных семей, что подтверждает ассоциацию повышенного Изменения количества копий de novo в семьях с простым аутизмом по сравнению с контрольными семьями (P = 0,0005). В этой статье подчеркивается полезность подхода как мощного первого шага в открытии генов и подчеркиваются потенциальные различия в генетической архитектуре, которые могут быть обнаружены в популяциях людей с аутизмом, обусловленные различными стратегиями набора.
Появление новой технологии, основанной на массивах, расширило обнаружение высокой частоты хромосомных аномалий у людей с РАС до субмикроскопического уровня, предлагая возможность ускорить усилия по идентификации генов, позволяя любому пациенту, а не только редкому человеку обнаруживать с большой микроскопической хромосомной перестройкой, чтобы быть потенциальным источником открытия. Кроме того, анализ CNV в настоящее время является единственным практическим методом анализа всего генома с высоким разрешением для выявления редких вариаций. В этом отношении они имеют огромные перспективы для идентификации аллелей большого эффекта при аутизме.
Одно предостережение заключается в том, что растущее число общих вариантов числа копий, идентифицированных у типично развивающихся индивидуумов, сопоставленных с экспрессируемыми в мозге генами (см. базу данных геномных вариантов, http://projects.tcag.ca/variation/), предполагает, что дифференциация патогенных -патогенные вариации останутся сложной задачей. Несомненно, некоторая приоритизация результатов может обогатить действительно вредные варианты: например, редкие изменения de novo, большие потери или поступления материала или гомозиготные делеции кодирования с большей вероятностью связаны с наблюдаемым фенотипом, чем небольшие, передаваемые и гетерозиготные изменения. Тем не менее, можно увидеть примеры этих потенциально патогенных CNV среди типично развивающихся людей, что позволяет предположить, что в некоторых случаях вариации, которые мы хотели бы предположить как патологические, могут на удивление хорошо переноситься в геноме. И наоборот, также следует ожидать, что исследователи в конечном итоге выявят CNV, несущие риск РАС, среди тех вариантов, которые априори могут считаться имеющими меньшую вероятность этого. В некоторых случаях эти проблемы будут идентичны тем, которые возникают при идентификации редких микроскопических хромосомных аномалий de novo. В других случаях высокая частота наблюдаемого изменения количества копий может обеспечить более прямой путь к демонстрации причинно-следственной связи, как обсуждается ниже.
Генетическая ассоциация
Генетическая ассоциация направлена на демонстрацию связи между генетическим вариантом и наличием фенотипа среди данной популяции. Это может быть важным шагом в исследовании сцепления или цитогенетического исследования для подтверждения актуальности открытия или отправной точкой для генетического исследования. В отличие от сцепления, при котором подтверждение такой связи ищут путем наблюдения за генетическими передачами внутри семей, стратегии ассоциации основаны на перекрестных исследованиях популяций. Это различие иногда затемняется в современных аналитических подходах, которые могут комбинировать эти методы, используя, например, изучение передач в большой группе семей для оценки сцепления при наличии ассоциации. Эти методы иногда называют семейными ассоциативными исследованиями.
Общие и редкие варианты ассоциаций
На протяжении большей части последнего десятилетия генетическая ассоциация была синонимом исследования общих вариаций в одном или нескольких генах-кандидатах или рядом с ними. Хотя эти исследования экономически эффективны и довольно популярны, на практике этот подход имел несколько ограничений: во-первых, очень немногие ассоциации генов-кандидатов, идентифицированные в литературе, впоследствии были воспроизведены [Hirschhorn et al., 2002]. Эта трудность может указывать на то, что первоначальный результат был обусловлен исключительно случайностью, что случай и контроль не были должным образом сопоставлены, что привело к ложным результатам, или что генетические риски в первой популяции отличались от тех, в популяции, в которой была предпринята попытка репликации. Среди этих альтернатив первые две заслуживают особого внимания: по мере того как новые более мощные подходы к ассоциации начали выявлять общие аллели риска при различных расстройствах, становится все более очевидным, что для многих ранних исследований генов-кандидатов размеры выборки были порядка величина слишком мала для выявления умеренных рисков, связанных с наиболее распространенными вариантами. Кроме того, трудности надлежащего сопоставления случаев и контроля в ассоциативных исследованиях особенно сложны в отношении этнической принадлежности. Хотя ясно, что частота полиморфизмов последовательностей значительно различается в разных этнических группах, трудность выявления скрытых различий в составе контрольной и контрольной групп (так называемая этническая стратификация) может быть важным источником ложноположительных результатов. К счастью, по мере развития ассоциативных исследований были разработаны и широко используются подходы к защите от этой ответственности.
Вторая примечательная характеристика исследований генов-кандидатов распространенных вариантов заключается в том, что они по существу слепы к редким вариациям. Подход основан на предположении, что любой аллель риска является либо общим тестируемым полиморфизмом, либо находится в неравновесном сцеплении с известным общим аллелем. Редкие варианты даже в одном исследуемом гене, как правило, упускаются при таком подходе.
Учитывая понимание потенциальной роли редких мутаций в развитии аутизма, резко возрос интерес к модификации ассоциативных подходов для оценки редких вариантов. Как и в случае с распространенными вариантами, можно задаться вопросом, является ли редкий вариант гена чрезмерно представленным в случаях по сравнению с контрольной группой, или он с большей вероятностью, чем ожидается, будет случайно передан пораженным детям в дизайне семейной ассоциации. Однако, в отличие от обычных исследований вариантов, ДНК в генах-кандидатах и вокруг них необходимо оценивать напрямую, чтобы идентифицировать ранее неизвестные редкие вариации в локусе. Технология для этого широко доступна; однако в настоящее время затраты на этот подход могут быть в 100 раз выше, чем на проведение обычного исследования вариантов в том же локусе.
Кроме того, подходы с редкими вариантами должны бороться с некоторыми из тех же путаниц, которые теперь признаются для исследований общих вариантов. Например, может быть ограниченное количество наблюдений за каким-либо конкретным геном, что позволяет предположить, что такие исследования также потребуют больших размеров выборки, чтобы обеспечить достаточную мощность и стабильность результатов. На самом деле, некоторые редкие варианты могут быть настолько редкими, что никакой разумный размер выборки не может обеспечить статистическую мощность, необходимую для установления связи. В этом случае пришлось бы использовать другие методы определения причинно-следственной связи, такие как демонстрация функциональной значимости редкого варианта, демонстрация его сегрегации внутри семейства, поиск дополнительных редких вариантов в генах, которые взаимодействуют с транскриптом, также ассоциированным с фенотипом. и/или демонстрация биологической значимости мутации в модельной системе.
Важно отметить, что любой редкий вариант, идентифицированный в гене-кандидате, независимо от того, обнаружен ли он в случаях или контроле, вряд ли будет обнаружен снова (поскольку он встречается редко). Следовательно, наблюдение, что какой-то отдельный вариант присутствует в одной группе, а не в другой, не обязательно предполагает связь. По этой причине исследования редких вариантов лучше всего проводить, исследуя совокупность редких функциональных вариантов в случаях по сравнению с контролем, исследуя каждую группу одинаковым образом, подход, известный как анализ бремени мутаций. Наконец, подходы с редкими вариантами также должны будут учитывать возможность этнической стратификации. Как уже отмечалось, существует несколько доступных методов для решения этой проблемы в обычных исследованиях вариантов. Необходимо будет тщательно рассмотреть, как они могут быть применены, или разработать дополнительные подходы для решения этой проблемы в исследованиях редких вариантов.
Среди распространенных вариантов исследований-кандидатов в последние годы наблюдается четкая тенденция к более строгим с методологической точки зрения усилиям, включая применение соответствующих статистических порогов, опору на более крупные размеры выборки, внутреннюю репликацию перед публикацией и отслеживание первоначальных доказательств связи с поиском функциональных вариант, лежащий в основе статистического вывода. Недавние исследования SLC6A4, Engrailed 2 и MET представляют собой три примечательных исследования в этом отношении [Benayed et al., 2005; Кэмпбелл и др., 2006 г.; Сатклифф и др., 2005]. Эти и другие детали подробно рассмотрены в других работах [Bacchelli and Maestrini, 2006; Фрайтаг, 2007 г.; Пардо и Эберхарт, 2007]. Здесь мы рассмотрим два других недавних открытия ассоциации: конвергенция исследований распространенных и редких вариантов, оценивающих ген CNTNAP2, и обнаружение ассоциации CNV на хромосоме 16p11.
Контактин-ассоциированный белок-подобный 2
CNTNAP2 является членом семейства нейрексинов молекул адгезии нейронов. Недавно четыре исследования предоставили доказательства того, что CNTNAP2 связан и связан с аутизмом. Как уже отмечалось, этот ген был впервые вовлечен в РАС в ходе исследования сцепления редких синдромальных пациентов с эпилепсией, аномалиями миграции нейронов, МР и аутизмом. Впоследствии в трех независимых исследованиях использовались самые разные подходы, но они сошлись на одной и той же расшифровке в исследованиях идиопатического аутизма.
Аларкон и др. [2008] использовали двухэтапное ассоциативное исследование для изучения 2758 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в области 15 Mb, охватывающей локус количественных признаков аутизма 7q35, связанный с речью, который они ранее идентифицировали [Alarcon et al., 2002, 2005]. . На этапе 1 172 трио из Обмена генетическими ресурсами аутизма (AGRE) были проверены на связь с возрастом, в котором ребенок произнес свое первое слово. Четыре гена достигли порога стадии 1 и были исследованы в независимой группе из 304 трио AGRE. Анализ данных стадии 2 показал, что SNP rs2710102 в CNTNAP2 был единственным маркером, который оставался значимым (P = 0,028). Анализ семей, состоящих только из мужчин, показал, что они в основном вносили вклад в ассоциацию (P = 0,005).
Аркинг и др. [2008] выполнили полногеномную ассоциацию 72 мультиплексных семей с использованием массивов Affymetrix 500 тыс. (Санта-Клара, Калифорния), где все затронутые члены имели строгий диагноз аутизма. Они не обнаружили локусов, соответствующих полногеномной значимости, с помощью теста неравновесия передачи (TDT). Впоследствии они проанализировали данные на предмет сцепления и обнаружили два локуса с предполагаемыми пиками сцепления на 7q35 (LOD = 3,4) и 10p13–14 (LOD = 2,9). Ассоциативный анализ интервала 7q35 с использованием TDT показал один связанный SNP rs7794745, в котором аллель T был сверхтрансмиссивным (перестановка P<0,006). Анализ TDT на дополнительном наборе из 1295 независимых троек с использованием широкого диагноза аутизма подтвердил связь с rs7794745 (P<0,005). Субанализ показал, что чрезмерная передача была значительно выше от матерей, чем от отцов. Генетический эффект наблюдался в основном у больных мужского пола; однако пострадавшие женщины были недостаточно представлены в выборке.
Баккалоглу и др. [2008] идентифицировали CNTNAP2 как цитогенетический ген-кандидат для когнитивной и социальной задержки на основании его нарушения у больного ребенка с инверсией хромосомы 7 de novo. Бремя редких миссенс-вариаций оценивали в схеме «случай-контроль» путем секвенирования всех кодирующих экзонов в 635 случаях РАС и 942 контролях. В группе случаев было идентифицировано 13 редких и уникальных вариантов, восемь из которых были предсказаны как вредные/консервативные. В контроле было идентифицировано 11 редких и уникальных вариантов, шесть из которых были предсказаны как вредные/консервативные. Это представляет собой примерно двукратное увеличение мутационного бремени; однако это различие не достигло статистической значимости. Один вариант, I869T, был обнаружен в трех семьях, но не среди 4010 контрольных хромосом, поддерживающих ассоциацию для этого отдельного аллеля (P = 0,014), с той оговоркой, что авторы не могли исключить ложноположительную ассоциацию из-за стратификации. Хотя исследование не выявило статистически значимого увеличения количества редких мутаций, выявления хромосомной аномалии de novo, обнаружения множественных редких предположительно функциональных миссенс-мутаций и более раннего обнаружения Strauss et al. [2006], все предполагают, что редкие варианты в CNTNAP2 требуют дальнейшего внимания. Более того, важно отметить, что исследование проводилось в выборке AGRE, которая в основном состояла из мультиплексных семей, и, таким образом, можно было бы ожидать, что вероятность выявления редких мутаций de novo в этом локусе будет меньше, чем в простой выборке.
В целом четыре недавних исследования представляют доказательства того, что как распространенные, так и редкие вариации CNTNAP2 могут способствовать риску развития РАС. Почти одновременная конвергенция независимых лабораторий по одному гену с использованием различных подходов беспрецедентна в литературе по аутизму. Однако было бы преждевременно считать эти исследования либо окончательными, либо истинными повторениями. Во всех четырех исследованиях были идентифицированы разные варианты, и обнаруженная ассоциация и сцепление не были связаны с идентичным фенотипом. Следовательно, для будущих исследований будет крайне важно попытаться воспроизвести ассоциации как общих, так и редких вариантов, определить функциональные аллели, лежащие в основе результатов общих вариантов, изучить биологию идентифицированных редких аллелей миссенс и исследовать семьи симплексов на присутствие редкие функциональные мутации de novo в CNTNAP2 среди людей с идиопатическим аутизмом.
16п11.2
Недавняя работа подчеркивает как потенциальные преимущества, так и проблемы, с которыми сталкиваются исследования ассоциации CNV при РАС. Одна из удаленных de novo областей, обнаруженная Sebat et al. [2007], 16p11.2, несколько раз (∼1%) идентифицировали как переменную количества копий (делеции и дупликации) в аутичных семьях [Kumar et al., 2008; Вайс и др., 2008 г.; Маршалл и др., 2008]. Кумар и др. [2008] использовали полные геномные массивы бактериальных искусственных хромосом (зонды 19K) для анализа 180 пробандов AGRE из 19 простых и 161 мультиплексных семей и 372 контролей. Они выявили рецидивирующую делецию de novo размером примерно 500 т.п.н. в 16p11.2 у двух пациентов с аутизмом, которая отсутствовала в контрольной группе. Среди дополнительных 532 пробандов из 68 простых и 464 мультиплексных семей были выявлены две делеции de novo и унаследованная дупликация. В 465 дополнительных контролях были идентифицированы две дупликации и ни одной делеции. Комбинированный анализ достиг порога значимости связи делеций 16p11.2 и аутизма (4/712 против 0/837; точный критерий Фишера P=0,044).
Совсем недавно Weiss и соавт. [2008] использовали массивы генотипирования Affymetrix, состоящие примерно из 500 тыс. SNP-зондов, для анализа 751 семейства AGRE и идентифицировали те же пять CNV 16p11.2, отмеченные выше (четыре делеции de novo и одна унаследованная дупликация), а также два новых семейства с дупликациями этого региона. , один из которых был de novo, а другой передан. Среди 1087 человек с биполярным расстройством, которые использовались в качестве контроля на этом этапе исследования, были выявлены три делеции, но ни одна из них не была обнаружена в дополнительных 1727 образцах из генетического репозитория Национального института психического здоровья или среди родителей AGRE.
Затем исследователи изучили смешанную популяцию клинических случаев из 512 детей с задержкой развития, МР или РАС; и контрольная популяция из 434 пациентов, направленных на цитогенетическую оценку, у которых не было задержки развития, МР или РАС. Были идентифицированы три независимые делеции de novo (одна делеция обнаружена у пары монозиготных близнецов) и одна делеция была унаследована от матери с легкой МР. Также наблюдались четыре дополнительных дупликации. Наконец, исландская популяция была проанализирована с 299 пациентами с РАС и 18 834 нефенотипированными контрольными группами. В этих случаях наблюдались три делеции: одна de novo, одна, унаследованная от отца с синдромом дефицита внимания и гиперактивностью, и одна неизвестного происхождения. В контроле наблюдали две делеции и пять дупликаций. Сравнение этой когорты (3/299 против 7/18 834, P = 0,00042) предоставило самые убедительные доказательства связи CNV 16p11.2 с РАС.
Эта ассоциация была недавно воспроизведена в независимой (не AGRE) группе пациентов. Маршалл и др. [2008] выполнили анализ CNV у 427 независимых пробандов (418 идиопатических случаев) с использованием 500 тыс. массивов Affymetrix. Было обнаружено, что одна и та же область 16p11.2 дважды продублирована (один раз de novo, один раз унаследована) и дважды удалена (оба de novo), что является аномальным примерно в 1% исследованных семей. CNV в 16p11.2 отсутствовали в их контрольном наборе (1652), что снова подтверждает связь изменений числа копий в 16p11.2 и ASD (точный критерий Фишера P = 0,002). Было идентифицировано несколько других предполагаемых специфических для РАС de novo и унаследованных CNV, некоторые из которых представляли собой повторяющиеся перестройки.
Хотя эти исследования продемонстрировали связь CNV 16p11 с РАС, результаты также подчеркнули как генотипические, так и фенотипические сложности, отмеченные в начале этого обзора. Передававшиеся варианты показали неполную пенетрантность, что ожидается даже для моногенетических признаков. Однако, кроме того, ни мутации de novo, ни унаследованные дупликации последовательно не сегрегируют внутри семьи, а это означает, что пораженные братья и сестры не разделяют мутацию. Для менделевского признака это наблюдение будет категорически против причинно-следственной связи для варианта. Однако при сложных расстройствах открытие может свидетельствовать о том, что в этих семьях присутствуют множественные аллели риска. Что ясно, так это то, что на основании имеющихся данных наличие делеции или дупликации этой области не является ни необходимым, ни достаточным для развития аутизма. Кроме того, Weiss et al. [2008] выявило возможность того, что CNV в этой области может предрасполагать к целому ряду психических фенотипов, поскольку делеции были обнаружены с относительно высокой частотой у лиц с расстройствами, включая шизофрению (1/648), биполярное расстройство (1/420) , синдром дефицита внимания и гиперактивности (1/203), дислексия (1/748) и паническое расстройство/тревога/депрессия или зависимость (1/3000). Дупликации также были обнаружены среди лиц с биполярным расстройством (2/420). Дополнительные исследования ассоциации этого CNV как при РАС, так и при других расстройствах, с особым вниманием к потенциальной стратификации населения, а также исследования как редких, так и распространенных вариаций в генах, картирующихся в этом регионе при идиопатическом аутизме, обещают помочь прояснить эти важные вопросы.
Новые технологии и подходы
Следующие несколько лет обещают быть чрезвычайно продуктивным периодом для исследований РАС благодаря нескольким ключевым технологическим достижениям. Во-первых, платформы для генотипирования продолжали улучшаться как с точки зрения плотности, так и с точки зрения точности вызовов. Текущая плотность маркеров в сочетании с низкими затратами на использование этих массивов сделали реальностью исследования ассоциаций всего генома. Этот подход оценивает риск, связанный с распространенными вариантами, но делает это без априорных гипотез. Хотя метод слеп к редким вариациям, уже было продемонстрировано, что он чрезвычайно эффективен при идентификации общих аллелей с небольшим эффектом, способствующих сложным общим расстройствам [Hirschhorn and Daly, 2005; Кляйн и др., 2005; Саксена и др., 2007 г.; Скотт и др., 2007 г.; Зеггини и др., 2007 г.; Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007], и вскоре будут опубликованы первые крупномасштабные полногеномные ассоциативные исследования РАС.
Конечно, развитие технологии микрочипов также открыло новую эру описания и открытия CNV [Kumar et al., 2008; Себат и др., 2007 г.; Консорциум проекта генома аутизма, 2007 г.; Вайс и др., 2008 г.; Marshall et al., 2008] Как уже отмечалось, эти инструменты позволили с высоким разрешением обнаруживать редкие изменения и изменения de novo в масштабе всего генома. Исследования в этой области, вероятно, резко возрастут в самом ближайшем будущем, тем самым предоставив важную новую информацию как о базовой архитектуре РАС, так и выявив множество новых локусов-кандидатов, требующих интенсивного изучения.
Наконец, технологии секвенирования переживают ренессанс, который обещает оказать глубокое влияние на открытие генов при всех сложных генетических заболеваниях, включая РАС. В настоящее время доступно несколько коммерческих технологий секвенирования следующего поколения, которые позволяют реализовать новую волну амбициозных крупномасштабных проектов секвенирования. 454 (Roche), Solexa (Illumina, Сан-Диего, Калифорния) и Solid (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния) — это три современные технологические платформы, которые позволяют создавать последовательности от сотен до тысяч мегабаз за один прогон. За счет увеличения производительности и снижения затрат в 10–100 раз экономически осуществимо множество новых направлений исследований. В конечном счете, эти технологии позволят проводить всестороннее секвенирование всего генома человека, выявляя как распространенные, так и редкие вариации, CNV и даже экспрессию генов.
Несмотря на захватывающие недавние открытия и перспективы новых технологий, есть, конечно, и серьезные проблемы, с которыми продолжают сталкиваться усилия по открытию генов при аутизме. В настоящее время наиболее актуальной с генетической точки зрения является необходимость резкого увеличения количества доступных образцов ДНК. Все приведенные недавние данные исследований РАС и результаты других областей медицины предполагают, что, как минимум, наборы образцов в 10–20 раз больше, чем доступны в настоящее время (около 20–40 000 образцов), вероятно, потребуются для обеспечения этого важного, но будут выявлены тонкие общие генетические риски и освещена роль редких вариантов.
Чтобы удовлетворить эту насущную потребность, клинические исследователи и генетики должны вместе творчески подумать о том, как увеличить число хорошо охарактеризованных пациентов для достижения этой амбициозной цели. Существует внутреннее противоречие между настоятельной необходимостью получить эти размеры выборки и трудоемкими подходами к диагностике и оценке, характерными для исследований аутизма. Это чрезвычайно квалифицированное и детальное фенотипирование абсолютно необходимо для понимания траекторий развития при аутизме, для ответа на важные вопросы, касающиеся феноменологии и вмешательства, а также для помощи в выявлении генетических рисков. В то же время при нынешних темпах самые большие усилия по сбору образцов аутизма не приблизится к числу, которое, вероятно, потребуется для окончательных ответов в течение 5 и более лет, несмотря на то, что геномные инструменты для анализа этих данных в значительной степени доступно сегодня. Более того, если руководствоваться другими областями медицины, наиболее важной фенотипической информацией для первой волны успешных полногеномных ассоциативных анализов и крупномасштабных исследований редких вариантов вполне может быть постановка надежного диагноза.
Эти реалии предполагают, что область не может позволить себе менталитет с нулевой суммой, в котором генетики имеют доступ либо к большему количеству образцов, либо к хорошо охарактеризованным образцам. Основная задача состоит в том, чтобы обеспечить параллельные пути, поддерживающие детализированное, всестороннее и очень творческое фенотипирование, и в то же время как можно быстрее продвигаться к рационализации надежных диагностических инструментов и эффективно использовать их для достижения размеров выборки, которые, как мы теперь имеем серьезные основания полагать, будут ключ к окончательному выяснению как общих, так и редких генетических рисков, способствующих РАС.
Выводы
Есть огромный повод для оптимизма в отношении открытия генов РАС сейчас и в ближайшем будущем. В то же время мы должны помнить, что идентификация изменений в последовательности ДНК, несущих риск развития РАС, будет решающим первым препятствием на пути к раскрытию тайн аутизма. Затем это будут совместные усилия междисциплинарных исследователей, использующих достижения в области нейробиологии развития, чтобы понять аутизм на молекулярном уровне, объединяя генетическое понимание с данными нейровизуализации и лечения, и возвращаясь к изучению исчерпывающе охарактеризованных клинических и эпидемиологических образцов с аллелями риска. , которые откроют двери для новых идей, которые обещают существенно изменить жизнь наших пациентов и их семей.
Впервые опубликовано: 07 марта 2008 г.
P.S.
Перевод с оригинала: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/aur.3