Чтобы получить хорошее контрастное изображение клетки в самом простом микроскопе, на образец можно капнуть йод — он накопится между клетками, подкрашивая их контуры. Но биологам часто требуется решать более сложные задачи: окрашивать отдельные органоиды или молекулы внутри самой клетки. Особым случаем является изучение живых клеток, и здесь флуоресцентные красители должны быть не только яркими, но еще и нетоксичными. Для этой цели в девяностые годы была разработана палитра флуоресцентных белков на основе природного зеленого белка (GFP) из медузы Aequorea victoria, которые обладают своими минусами. Ученые из МФТИ решили разработать альтернативные флуоресцентные белки для создания более универсальной многоцветной визуализации.
Результат научной работы опубликован в Journal of Biological Chemistry. «Если мы смотрим на клетку в микроскоп на просвет, то она кажется почти прозрачной, но если бы она была в темноте и при этом светилась сама, то увидеть ее было бы проще. Это и есть общая идея флуоресцентной микроскопии. Популярные GFP-подобные белки-красители отлично подходят для такой задачи, но все же в некоторых случаях их применение затруднено. У них довольно большой размер, а еще они не светятся без кислорода. В рамках нашего исследования мы создали флуоресцентные красители на основе другого белка, который имеет свои преимущества и недостатки», — рассказал о своей работе Андрей Николаев, ведущий автор, сотрудник лаборатории структурного анализа и инжиниринга мембранных систем МФТИ.
Ученые рассмотрели флавинсвязывающие флуоресцентные белки (FbFP). К группе флавинов относится, например, витамин B2 или другие соединения, содержащие флавин-группу. FbFP создаются на основе LOV-доменов — сенсоров синего света. Природные LOV-домены, поглощая энергию синего фотона, тратят ее на передачу механического сигнала соседним доменам. Если сломать этот механизм мутациями в белке, домену ничего не остается, кроме как отдать излишек энергии, излучив фотон. Именно так устроена зеленая флуоресценция FbFP. Эти белки вдвое меньше GFP и по массе, и по длине гена, а также не зависят от кислорода.
Ученые внесли много мутаций для того, чтобы монохром FbFP стал семейством белков разных цветов, что оказалось гораздо сложнее, чем в случае с GFP. Оказалось, что эти белки плохо поддаются настройке спектров поглощения и флуоресценции, и это первая успешная попытка создания палитры из 22 точно настроенных флуоресцентных меток с максимумами эмиссии, равномерно охватывающими диапазон длин волн от 486 до 512 нанометров.
«Использование природных белков для решения исследовательских и прикладных задач — очень многообещающая область науки. При этом часто необходима доработка, и при помощи инженерии из белков получаются полезные молекулярные инструменты. В данной работе нам удалось создать палитру светящихся белков для микроскопии сразу нескольких микроорганизмов, а в будущем мы планируем применить эти же подходы для разработки эффективных ферментов для биотехнологии», — подчеркнул Иван Гущин, заведующий лабораторией структурного анализа и инжиниринга мембранных систем МФТИ.
В качестве доказательства концепции ученые рассмотрели под микроскопом клетки, в которых жидкая составляющая — цитоплазма — и сеть митохондрий окрашены двумя белками из палитры. Для невооруженного глаза свечения этих белков выглядели бы как два оттенка зеленого, однако современные микроскопы более чувствительны к цветам, чем люди. Ученые приводят снимки как в реальных цветах, так и в цветах, усиленных микроскопом. Эти результаты подчеркивают возможность изменения спектра флавопротеинов и прокладывают путь для практического применения FbFP как флуоресцентной метки. Исследование выполнено при поддержке Российского научного и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.