ВРТ стали основой лечения бесплодия, позволившие родить более 2 миллионов детей в Европе за последнее десятилетие. За последние годы количество процедур значительно увеличилось, в 2017 году в Европе было проведено почти 1435 циклов на миллион жителей по сравнению с 474 циклами в год на миллион в период с 2008 по 2010 год.
Хотя ИКСИ является наиболее используемым методом ВРТ в Европе (2,1 цикла икси на обычный цикл ЭКО), он не дает преимущества перед ЭКО при бесплодии не связанному с мужским фактором. Поскольку эффективность ИКСИ была стабильной на уровне от 21% до 23% в период 2009-2017 годов, разработка новых методов для повышения успеха ВРТ и исследование факторов, лежащих в основе неудач при имплантации, является оправданным. Разработка новых диагностических инструментов, медицинских устройств или процедур, является непростой задачей, поскольку исследования фертильности человека связаны со многими техническими различиями, гетерогеностью популяции и межиндивидуальными вариациями.
В то время как мужской фактор бесплодия присутствует у половины пар, обращающихся за медицинской помощью, в предыдущих исследованиях, связанных с ВРТ, больше внимания уделялось женскому фактору. Кроме того, хотя обычная спермограмма (концентрация, подвижность и морфология) может не иметь прямого отношения к частоте оплодотворения и качеству эмбрионов после ИКСИ, все еще неясно, влияют ли другие переменные спермы, такие как дефекты хроматина, на развитие эмбриона и клинические исходы после ВРТ.
Недавний метаанализ о влиянии повреждения ДНК на результаты ЭКО и ИКСИ показал, что целостность ДНК оказывает негативное влияние на показатели имплантации и беременности при обычном ЭКО, но не при ИКСИ, поскольку результаты не достигли статистическая значимости. По этой причине вопрос о том, оказывает ли хроматин сперматозоидов негативное влияние на успех ИКСИ, остается открытым.
Чтобы защитить геном отца от генотоксических агентов, гистоны заменяются протаминами в хроматине зрелых сперматозоидов в процессе, который, как полагают, включает сайты связывания ctcf (cctc-binding factor). Протамины сшиты посредством окисленных дисульфидных связей, которые помогают стабилизировать хроматин сперматозоидов в тороидальные структуры. После оплодотворения формирование мужского проядра требует замены протаминов гистонами и эпигенетического перепрограммирования отцовского генома. Инъекция круглых сперматид, которые не содержат протаминов, приводит к нарушению развития эмбриона; следовательно, эти белки, играют жизненно важную роль в событиях после оплодотворения. Кроме того, из-за разрывов ДНК страдает не только целостность хроматина сперматозоидов, но и дефицит протамина и преждевременное сокращение дисульфидных мостиков в зрелых сперматозоидах, что оказывает пагубное влияние на мужскую фертильность. Эти недостатки, которые приводят к образованию участков хроматина с незащищенной ДНК, могут нарушать формирование мужского пронуклеуса и оказывать неблагоприятное воздействие на развитие эмбриона.
Насколько известно авторам, ни в одном исследовании ранее не оценивалось, как уменьшение содержания дисульфида в сперматозоидах и, следовательно, деконденсация хроматина изменяет результаты ИКСИ у людей.
Кроме того, связь между протаминацией хроматина и успехом ИКСИ противоречива в литературе(некоторые авторы обнаружили связь между плохим протаминацией и сниженными показателями оплодотворения (Тavalaee et al., 2009; Iranpour, 2014), другие сообщили об обратном (Nijs et al., 2009; Gill et al., 2018). Стоит отметить, что ранее не проводилось исследований по оценке образования хроматина сперматозоидов в циклах, в которых как сперматозоиды, так и яйцеклетки поступали от здоровых молодых доноров, следовательно, возможно, что большая часть наших текущих знаний в этой области была искажена смешивающими факторами, присутствующими в бесплодных когортах; В этом случае использование исследования здоровых людей обеспечило бы другой подход к пониманию того, что приводит к мужскому бесплодию.
Таким образом, целью настоящего исследования было определить взаимосвязь протаминации и конденсации хроматина сперматозоидов с результатами ИКСИ в циклах, включающих яйцеклетки здоровых женщин.
В ходе исследования было отобрано 2 группы:
💠первая когорта (когорта двойного донорства (dd)) включала 45 доноров спермы, использованных в 55 циклах ИКСИ (всего был получен 491 эмбрион); яйцеклетки были получены от здоровых женщин-доноров, и каждый набор эмбрионов был передан одной паре.
высококачественные бластоцисты из этих 55 циклов ИКСИ были переданы бесплодным женщинам.
💠вторая когорта (когорта одиночного донорства (sd)) состояла из 34 доноров спермы, использованных в 41 цикле ИКСИ (всего было получено 378 эмбрионов); яйцеклетки были получены от одиноких женщин, которым требовался донор спермы(35 от семьи с одним родителем и шесть от однополых пар). Эмбрионы высокого качества были переданы той же женщине, которая предоставила яйцеклетки в случае семейных циклов с одним родителем, и партнеру в случае однополых пар.
❇️Из пар, включенных в когорту sd, у 14,63% ранее была естественная беременность.
❇️включение в две исследуемые когорты (dd и sd) призвано представлять различных здоровых людей, которых можно найти в общей популяции. В когорту dd вошли тщательно отобранные доноры яйцеклеток, чей возраст был <35 лет. в когорту sd вошли женщины, которые не сообщали о проблемах с репродуктивной системой в анамнезе, могли быть старшего репродуктивного возраста и даже могли пытаться забеременеть. Эта когорта sd была бы более репрезентативной для общего здорового населения, пытающегося забеременеть.
❇️образцы донорской спермы из групп dd и sd использовались для стандартной ИКСИ, а развитие эмбрионов наблюдалось с помощью покадровой визуализации. частоту снижения содержания тиола(dbb) и степень протаминации хроматина (хромомицин a3, cma3, указывающий на непротаминированные участки) в сперме определяли методом проточной цитометрии через 0 и 4 ч после оттаивания.
Основные результаты:
✅процентное стандартное отклонение cma3 составило 21,08 ± 9,09 и 35,01 ± 14,68 через 0 и 4 ч после оттаивания, соответственно, в когорте dd и 22,57 ± 9,48 и 35,79 ± 12,58 через 0 и 4 ч после оттаивания, соответственно, в когорте sd.
✅процентное содержание dbb составило 16,57 ± 11,10 и 10,51 ± 8,40 через 0 и 4 ч после оттаивания (р < 0,0001) соответственно в группе dd и 17,98 ± 10,19 и 12,72 ± 8,76 через 0 и 4 ч после оттаивания (р<0,0001) соответственно
✅возраст женщины коррелировал со скоростью оплодотворения, а связь между хроматином сперматозоидов и развитием эмбриона определялась с помощью множественной линейной регрессии.
✅в то время как cma был связан с частотой оплодотворения, без влияния возраста женщины, в когорте dd (b, = -1,036, p < 0,001 для cma3: b, = 0,667, p = 0,304 для женского возраста), этого не наблюдалось в когорте sd, где возраст женщины имел значительную роль, маскирующий эффекты cma3 (b, = 0,066, p = 0,804 для cma3: b =1,451, p =0,003 для женского возраста).
✅способность сперматозоидов конденсировать свой хроматин in vitro после 4 часов инкубации была связана с частотой образования бластоцист независимо от возраста женщин (когорта dd: b -0,238, p = 0,008 для вариации "dbb"; b2 = 0,404, p = 0,638 для женского возраста; когорта sd: b1 = -0,278, p = 0,010 для вариации "%dbb"; b. = -0,292, p = 0,594 для женского возраста).
✅способность сперматозоидов конденсировать свой хроматин in vitro также была связана с требуемым временем
✅Для достижения эмбрионом стадии бластоцисты в когорте dd (р = 0,007). ✅наконец, множественная логистическая регрессия показала, что как протаминация, так и конденсация хроматина, а также возраст доноров яйцеклеток и реципиентов эмбрионов оказали влияние на достижение беременности (р < 0,01) и на показатели живорождения (р < 0,01).
Основываясь на текущих данных, можно предположить, что оценка конденсации сперматозоидов может помочь предсказать развитие эмбриона после ИКСИ, при использовании молодых клеток. При оценке клинических исходов множественная логистическая регрессия показала, что конденсация и протаминация сперматозоидов зависят от возраста доноров и реципиентов эмбрионов;
Стоит подчеркнуть, что ни в одном предыдущем исследовании не изучалось совместное влияние изменений хроматина сперматозоидов и возраста женщины на показатели оплодотворения и развитие эмбрионов в циклах ИКСИ с использованием гамет здоровых индивидуумов. Принимая во внимание эти результаты, представляется, что оценка параметров хроматина сперматозоидов, скорректированных в зависимости от возраста женщины, может быть использована для прогнозирования результатов ИКСИ.
Наконец, стоит отметить, что ограничительный отбор пар, проведенный в настоящем исследовании, привел к относительно небольшому размеру выборки, что могло повлиять на наблюдаемые результаты. По этой причине и для уменьшения ошибки i типа уровень значимости составляет p< 0,01. Кроме того, может быть ограничено использование криоконсервированных образцов; Таким образом, крайне необходимы дальнейшие исследования, направленные на выяснение того, влияет ли криокосервация на протаминацию и конденсацию хроматина.
Подводя итог можно сделать три основных вывода.
✅во-первых, в то время как плохое протаминирование хроматина сперматозоидов отрицательно влияет на показатели оплодотворения в циклах ИКСИ с участием гамет от здоровых доноров, возраст женщины оказывает влияние и маскирует потенциальный эффект изменений хроматина сперматозоидов при тестировании женщин более старшего возраста.
✅во-вторых, способность сперматозоидов in vitro конденсировать свой хроматин после 4 часов инкубации коррелирует с частотой образования бластоцист и развитием эмбрионов, и эта связь не зависит от возраста женщины, производящих яйцеклетки.
✅наконец, у здоровых индивидуумов статус хромосомы (протаминация и конденсация), возраст женщины, дающих яйцеклетки, и возраст тех, кто получает эмбрионы, связаны с частотой наступления беременности и успешными живорождениями после ИКСИ.