Микрофотографии смежных фронтальных срезов, контрастно окрашенных нейтральным красным на уровне перифорникального ядра гипоталамуса. A, Нейроны Hcrt были помечены с помощью антисыворотки № 2050 против С-концевой 17-аминокислотной части препропротеина. B, Иммунореактивность гипокретина отсутствовала после преинкубации антисыворотки № 2050 с целым препропротеином, что показывает, что это антитело специфически распознает hcrt. C, Нейроны Hcrt были помечены антителом № 2123.
Идентичное окрашивание было получено с обеими антисыворотками. f, Свод. Масштабные линейки: 65 мкм
Микрофотографии, иллюстрирующие нейроны hcrt в перифорникальном ядре гипоталамуса. A. Нейроны, содержащие мРНК для hcrt, визуализированные с однородной красной окраской цитоплазмы с помощью техники гибридизации in situ с использованием быстрого красного в качестве субстрата для щелочной фосфатазы.
B. Увеличение A. C. Микрофотография, показывающая, что все нейроны, окрашенные в красный цвет после гибридизации in situ (распознавание мРНК hcrt с использованием быстрого красного), помечены черным цветом с помощью иммуногистохимии (распознавание белка с помощью антисыворотки № 2050) для hcrt. Этот результат указывает на то, что антисыворотка № 2050 специфична для hcrt.
D. Большое увеличение дважды помеченных клеток после гибридизации in situ (красный) и иммуногистохимии (черный).
E, Микрофотография нейронов, содержащих мРНК для меланин-концентрирующего гормона (помечены красным цветом с помощью гибридизации in situ с использованием Vector red в качестве субстрата) и нейронов hcrt (помечены черным цветом с помощью иммуногистохимии с использованием DAB с никелем в качестве субстрата). Обратите внимание, что нет клеток с двойной меткой, что указывает на то, что MCH и hcrt находятся в двух различных популяциях нейронов.
F, Большое увеличение нейронов MCH (красный) и hcrt (черный) в перифорникальном ядре. Масштабные линейки: A, C, E, 65 мкм; B, D, F, 36 мкм
Распределение нейронов, меченных hcrt, на фронтальных срезах на трех ростро-каудальных уровнях туберальной области гипоталамуса (от A до B и до C), определенное с использованием антисыворотки #2123.
Срезы были контрастно окрашены нейтральным красным (розовое окрашивание всех клеток).
Окрашивание нейтральным красным позволило нам определить точное расположение нейронов hcrt в мозге, которые локализуются исключительно в туберальной области гипоталамуса вентральнее zona incerta и которые простираются на 1 мм ростро-каудально, начинаясь каудальнее паравентрикулярного ядра гипоталамуса.
3V, 3-й желудочек;
Arc, дугообразное ядро;
DMH, DM, дорсомедиальное гипоталамическое ядро;
f, свод;
ic, внутренняя капсула;
opt, зрительный тракт;
SOR, ретрохиазмальная часть супраоптического ядра;
VMH, вентромедиальное гипоталамическое ядро;
ЗИ, зона неуверенности. Масштабные линейки, 275 мкм.
A, Крупные клетки в латеральном гипоталамусе иммунореактивны к гипокретину. Окрашивание было обнаружено в цитоплазме и дендритах (короткая стрелка), но не в ядре (длинная стрелка). Масштабная линейка, 15 мкм.
B, Электронно-микроскопическое исследование иммунореактивных нейронов показало точечное окрашивание в цитоплазме, часто связанное с плотными гранулами ядра и частями аппарата Гольджи (тонкая стрелка). Случайные органеллы около плотных гранул ядра иногда показывали метку пероксидазы, вероятно, из-за диффузии в процессе иммуноцитохимии.
GA, аппарат Гольджи;
HCRT, гипокретин;
NCL, ядрышко (толстая стрелка);
NU, ядро.
Схематические рисунки 20 мкм рострокаудальных коронарных срезов, иллюстрирующие распределение и относительную плотность волокон hcrt в префронтальной коре и обонятельной луковице после иммуногистохимии для hcrt с использованием антитела № 2050. aci, передняя комиссура, интрабульбарная часть;
AI, агранулярная островковая кора;
AOL, переднее обонятельное ядро, латеральная часть;
AOV, переднее обонятельное ядро, вентральная часть;
Cg, поясная кора;
E/OV, эпендима и субэпендимальный слой/обонятельный желудочек;
Fr, фронтальная кора;
l, клубочковый слой обонятельной луковицы;
IGr, внутренний зернистый слой обонятельной луковицы;
LO, латеральная орбитальная кора;
Mi, слой митральных клеток обонятельной луковицы;
MO/VO — медиальная/вентральная орбитальная кора;
Pir — грушевидная кора;
ТТ — tenia tecta;
VLO — вентролатеральная орбитальная кора;
ВН, вомероназальный нервный слой.
Схематические рисунки 20 мкм рострокаудальных коронарных срезов, иллюстрирующие распределение и относительную плотность волокон hcrt в конечном мозге после иммуногистохимии для hcrt с использованием антитела № 2050. aca, передняя комиссура, передняя часть;
AcbC, прилежащее ядро, ядро;
AcbSh, прилежащее ядро, оболочка;
AI, агранулярная островковая кора;
Cg, поясная кора;
Cl, ограда;
CPu, хвостатая скорлупа;
DEn, дорсальное эндогрушевидное ядро;
DI, дисгранулярная островковая кора;
fmi, малые щипцы мозолистого тела;
Fr, лобная кора;
gcc, колено мозолистого тела;
GI, зернистая островковая кора;
HDB, ядро горизонтальной ножки диагональной полосы;
ICj, островки Каллея;
ICjM, острова Каллея, большой остров;
lo, латеральный обонятельный тракт;
LSI, латеральное перегородочное ядро, промежуточная часть;
LSV, латеральное перегородочное ядро, вентральная часть;
LV, боковой желудочек;
Par, теменная кора;
Par1, теменная кора, область 1;
Pir, грушевидная кора;
SHi, септогиппокампальное ядро;
TT, tenia tecta; Tu, обонятельный бугорок;
VP, вентральный бледный шар.
Схематические рисунки 20 мкм рострокаудальных коронарных срезов, иллюстрирующие распределение и относительную плотность волокон hcrt на уровне преоптической области после иммуногистохимии для hcrt с использованием антитела № 2050.
3V, 3-й желудочек;
ac, передняя комиссура;
acp, передняя комиссура, задняя часть;
AHA, передняя гипоталамическая область, передняя часть;
AI, агранулярная островковая кора;
BSTL, ядро ложа конечной полоски, латеральный отдел;
BSTM, ядро ложа конечной полоски, медиальный отдел;
BSTV, ядро ложа конечной полоски, вентральный отдел;
cc, мозолистое тело;
Cg, поясная кора;
Cl, ограда;
CPu, хвостатая скорлупа;
DEn, дорсальное эндогрушевидное ядро;
f, свод;
FL, область передних конечностей коры;
Fr, лобная кора;
FStr, полосатое дно;
GI, зернистая островковая кора;
GP, бледный шар;
HDB, ядро горизонтальной ветви диагональной полосы;
HL, задняя область коры;
ic, внутренняя капсула;
LA, латеро-переднее гипоталамическое ядро;
lo, латеральный обонятельный тракт;
LOT, ядро латерального обонятельного тракта;
LPO, латеральная преоптическая область;
LV, боковой желудочек;
MCPO, крупноклеточное преоптическое ядро;
MPA, медиальная преоптическая область;
MPO, медиальное преоптическое ядро;
ox, зрительный перекрест;
Par, теменная кора;
Pir, грушевидная кора;
PVA, паравентрикулярное таламическое ядро, передняя часть;
SCh, супрахиазматическое ядро;
SFO, субфорникальный орган;
SHy, септогипоталамическое ядро;
SI, безымянная субстанция;
sm — мозговая полоска таламуса;
SO — супраоптическое ядро;
st — терминальная полоска;
TS — треугольное септальное ядро;
VP — вентральный бледный шар.
Схематические рисунки 20 мкм рострокаудальных коронарных срезов, иллюстрирующие распределение и относительную плотность волокон hcrt на уровне туберальной области гипоталамуса после иммуногистохимии для hcrt с использованием антитела № 2050.
Положение тел клеток hcrt обозначено точками в левом полушарии.
3V, 3-й желудочек; AHP, передняя гипоталамическая область, задняя часть; Arc, дугообразное ядро; AV, передневентральное ядро таламуса; BLA, базолатеральное ядро миндалевидного тела, передняя часть; BMA, базомедиальное ядро миндалевидного тела, передняя часть; CA1–CA3, поля CA1–CA3 рога Аммона; cc, мозолистое тело; Ce, центральное ядро миндалевидного тела;
CM, центральное медиальное ядро таламуса;
CPu, хвостатая скорлупа;
DEn, дорсальное эндопириформное ядро;
DG, зубчатая извилина; f, свод; fi, бахромка гиппокампа; G, студенистое ядро таламуса; GP, бледный шар; I, вставочные ядра миндалевидного тела; ic, внутренняя капсула; LDVL, латеродорсальное ядро таламуса, вентролатеральная часть; LH, латеральная гипоталамическая область; LHb, латеральное ядро поводка; LV, боковой желудочек; Me, медиальное миндалевидное ядро; mt, сосцевидно-таламический тракт; opt, зрительный тракт; PaMP, паравентрикулярное гипоталамическое ядро, медиальная мелкоклеточная часть; Pir, грушевидная кора; PoDG, полиморфный слой зубчатой извилины; PV, паравентрикулярное ядро таламуса; PVA, паравентрикулярное ядро таламуса, передняя часть; Re, ядро таламуса reuniens; Rh, ромбовидное ядро таламуса; Rt, ретикулярное ядро таламуса; sm, мозговая полоска таламуса; SOR, супраоптическое ядро, ретрохиазмальная часть; st, терминальная полоска; SubI, субинцертальное ядро; TC, область серого бугра; VL, вентролатеральное ядро таламуса; VMH, вентромедиальное ядро гипоталамуса; VPL, вентральное заднелатеральное ядро таламуса; VPM, вентральное заднемедиальное ядро таламуса; ZI, неопределенная зона.
Микрофотографии иммунореактивных аксонов hcrt в мозге крысы с использованием антисыворотки № 2123.
A, Темное поле иллюстрации толстых волокон hcrt (белого цвета), расположенных в голубом пятне, латеральнее 4-го желудочка. Обратите внимание, что волокна ограничены локусом и содержат многочисленные бутоны.
B, Микрофотография, показывающая, что волокна hcrt-IR были в основном длинными с варикозами. Плотность волокон была относительно низкой во всех областях коры, как показано на этом изображении лобной коры.
C, Иллюстрация многочисленных длинных и толстых волокон, наблюдаемых в каудальной части дугообразного ядра. Волокна Hcrt содержат многочисленные бутоны.
D, F, Микрофотографии, иллюстрирующие одну из основных проекций нейронов hcrt, паравентрикулярное ядро таламуса. Волокна были длинными с многочисленными варикозами, как показано на F на увеличенном в темном поле изображении D.
E, Микрофотография, показывающая высокую плотность варикозных волокон, расположенных в латеральном околоводопроводном сером веществе на уровне дорсального ядра шва.
Масштабные линейки: A, 36 мкм; B–D, 70 мкм; E, 50 мкм; F, 25 мкм.3V, 3-й желудочек; Aq, водопровод; LHb, латеральное ядро поводка.