Введение
Сосудистая кальцификация является распространенным патологическим фенотипом, характеризующимся эктопическим отложением минерала гидроксиапатита в сосудистой стенке, и ее патогенез тесно связан с воспалением [1]. Среди общей популяции в возрасте 45–75 лет распространенность кальцификации грудной аорты и кальцификации коронарных артерий достигла 63,1 и 46,7% соответственно [2].
Сосудистая кальцификация имеет сильную корреляцию со старением, хроническим заболеванием почек, диабетом, гипертонией и курением [3, 4]. Она может вызывать снижение сосудистой эластичности, утолщение артериальной стенки, люминальный стеноз, нестабильность бляшек и разрыв бляшек [5], что может привести к ряду сердечно-сосудистых заболеваний, а также неблагоприятным сердечно-сосудистым и цереброваскулярным событиям [6, 7]. Таким образом, сосудистая кальцификация считается основной причиной высокой заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний [4, 8]. Поскольку прогрессирование сосудистой кальцификации необратимо по своей природе и отсутствуют доступные эффективные терапевтические методы лечения, его профилактика и лечение имеют жизненно важное клиническое значение. Короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), в первую очередь, включая уксусную кислоту, пропионовую кислоту и масляную кислоту, являются метаболитами, вырабатываемыми путем ферментации пищевых волокон с помощью специфических анаэробных бактерий в толстой кишке [9, 10]. В последние годы сообщалось, что SCFA способны улучшать факторы риска, связанные с кардиометаболическими заболеваниями, что привлекает все больше внимания [11]. Соответственно, лечение SCFA может контролировать набор веса путем регулирования потребления калорий и расхода энергии [12], улучшать гомеостаз глюкозы в крови и резистентность к инсулину [13, 14], снижать уровень холестерина в плазме [15] и способствовать окислению жирных кислот [16]. Более того, улучшение этих признанных факторов риска может способствовать контролю возникновения и прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, SCFA могут оказывать глубокое благотворное влияние на сердечно-сосудистую систему благодаря своим противовоспалительным и регулирующим гомеостаз иммунитета функциям. SCFA могут снижать артериальное давление, улучшая сосудистую податливость [17–19]. Кроме того, недавние исследования показали, что добавление пробиотиков Lactobacillus регулирует иммунный ответ, а затем способствует восстановлению после инфаркта миокарда. Дальнейшие исследования показали, что после добавления пробиотиков общее содержание SCFA оставалось постоянным, но состав метаболитов варьировался в образцах сыворотки и кала. Уровни пропионата значительно увеличивались, в то время как уровни бутирата заметно снижались. Количество миелоидных клеток в миокарде значительно увеличивалось после добавления пропионата. Все эти результаты свидетельствуют о том, что кишечная микробиота вырабатывала специфические SCFA, которые регулировали иммунную систему, а затем воспалительную микросреду после инфаркта миокарда [20]. Кроме того, Bartolomaeus et al. обнаружили, что пропионат снижает системную воспалительную реакцию, атеросклероз и ремоделирование миокарда, вызванное гипертонией, посредством балансировки реакций Treg-клеток [21].
Поэтому предполагается, что пропионат SCFA может уменьшать сосудистую кальцификацию, оказывая противовоспалительное действие. SCFAs получаются из кишечной микробиоты и также могут регулировать гомеостаз кишечной микробиоты [22]. Кишечная микробиота является важным структурным компонентом кишечного барьера. Здоровая кишечная микробиота полезна для поддержания неповрежденной функции кишечного барьера, а неповрежденный кишечный барьер жизненно важен для состояния здоровья хозяина [23]. Кишечный микроэкологический дисбаланс может нарушить целостность кишечного барьера.
Следовательно, липополисахарид (ЛПС) в клеточной стенке грамотрицательных бактерий и вредные метаболиты, такие как триметиламин (ТМА), могут проникать в системный кровоток [24] и вызывать хронические воспалительные реакции in vivo, что может впоследствии привести к дисфункции эндотелия сосудов [25], атеросклерозу [26], кальцификации сосудов [27], сердечной недостаточности [28] и гипертонии [29].
Учитывая тесную связь SCFA, кишечной микробиоты и воспаления, взаимодействующих с кальцификацией сосудов, наше исследование предложило гипотезу о том, что пропионат SCFA может облегчить кальцификацию сосудов за счет улучшения барьерной функции кишечника и ослабления воспалительных реакций посредством ремоделирования кишечной микробиоты.
Результаты
Корреляционный анализ уровней SCFA (ацетат, пропионат и бутират) с показателями кальцификации Всего в этом исследовании приняли участие 92 пациента, что дало 89 образцов крови и 67 образцов кала (рис. 1а). Основные демографические и клинические характеристики участников, которые предоставили образцы плазмы и кала, показаны в Дополнительном файле 1: Дополнительная таблица 1 и Дополнительном файле 2: Дополнительная таблица 2 соответственно. Был проведен корреляционный анализ Спирмена, и уровни ацетата, пропионата и бутирата
Улучшение сосудистой кальцификации у крыс, вызванной VND, и снижение воспалительных реакций при пероральном и ректальном введении пропионата Чтобы прояснить влияние пропионата натрия (SP) на сосудистую кальцификацию, у крыс была вызвана сосудистая кальцификация, после чего им давали свободно пить SP (200 мМ) (рис. 2a) или ректально вводили 1 г/кг массы тела SP (дополнительный файл 5: дополнительный рисунок 1a).
Эксперимент длился 6 недель. Не было никакой существенной разницы в уровнях креатинина сыворотки между тремя группами (дополнительный файл 6: дополнительный рисунок 2b), за исключением влияния витамина D3 на почечные функции крыс. По сравнению с крысами группы VDN, отложение солей кальция явно снизилось в кровеносных сосудах крыс из группы VDN + SP (рис. 2b). Кроме того, количественное определение содержания кальция в аорте показало, что содержание кальция было значительно снижено на 59,2% в группе VDN + SP по сравнению с группой VDN (рис. 2c).
Аналогичным образом, окрашивание ализарином красным участков восходящей аорты показало, по-видимому, подавленное отложение соли кальция в кровеносных сосудах крыс из группы VDN + SP (рис. 2d).
Кроме того, относительное количественное определение соли кальция также показало, что содержание кальция в срезах тканей в группе VDN + SP снизилось на 64,8% (рис. 2e) по сравнению с группой VDN. Уровни провоспалительных цитокинов в плазме были измерены для дальнейшей оценки воздействия SP на системные воспалительные реакции.
По сравнению с группой VDN, группа VDN + SP продемонстрировала значительное снижение концентраций TNF-α (рис. 2f), IL-1β (рис. 2g) и IL-6 (рис. 2h) в плазме. Более того, инфильтрация макрофагов в стенке сосуда была ослаблена, а экспрессия TNF-α снижена (Дополнительный файл 7: Дополнительный рисунок 3a-c).
Аналогичным образом, ректальное введение пропионата улучшило вышеуказанные показатели (Дополнительный файл 5: Дополнительный рисунок 1b-h и Дополнительный файл 8: Дополнительный рисунок 4a-c). В конечном итоге, все эти результаты указывают на то, что пропионат не только улучшает вызванную VDN сосудистую кальцификацию, но и снижает воспалительные реакции.
введения пропионата
Здоровая кишечная микробиота обеспечивает структурную основу для поддержания барьерной функции кишечника. Неповрежденный кишечный барьер не только предотвращает проникновение вредных веществ из кишечной полости в организм, но и служит важнейшей основой для поддержания гомеостаза in vivo.
В нашем эксперименте мы проанализировали гистологию толстой кишки, чтобы изучить влияние перорального и ректального введения пропионата на целостность барьера кишечника у крыс, получавших VDN. По сравнению с контрольной группой, группа VDN показала критически поврежденные крипты толстой кишки у крыс (рис. 4a, b), истончение стенки кишечника (рис. 4a, c) и резкое сокращение количества бокаловидных клеток (рис. 4a, d). Слизистый белок 2 (MUC2) секретируется бокаловидными клетками и является наиболее обильно экспрессируемым муцином в слое слизи. Иммуногистохимический анализ показал, что количество MUC2-позитивных бокаловидных клеток было существенно снижено в группе VDN по сравнению с контрольной группой (рис. 4a, e).
Наблюдалось значительное накопление D-лактата и диаминоксидазы, биомаркеров кишечной проницаемости (рис. 4f, g), что указывает на колоссальное повышение кишечной проницаемости у крыс из группы VDN 1. После лечения SP наблюдалось явное улучшение структуры кишечного барьера, такой как глубина крипт (рис. 4a, b), толщина кишечной стенки (рис. 4a, c), количество бокаловидных клеток (рис. 4a, d) и накопление MUC2 (рис. 4a, e). Одновременно с этим увеличилась и проницаемость кишечного тракта (рис. 4f, g).
Корреляционный анализ показал, что параметры, связанные с кишечным барьером (например, глубина крипт, толщина стенки кишечника, количество бокаловидных клеток и накопление MUC2), отрицательно коррелировали с содержанием ЛПС, положительно коррелировали с уровнями SCFA и отрицательно коррелировали с уровнями D-лактата и диаминоксидазы (рис. 4h). Аналогичным образом, параметры слизистой оболочки кишечника и параметры проницаемости у крыс с кальцификацией сосудов, вызванной VDN, были улучшены при ректальном введении пропионата (дополнительный файл 13: дополнительный рисунок 7a-h). Вкратце, эти результаты указывают на то, что пероральное и ректальное введение пропионата может играть роль в защите слизистого барьера кишечника.
В заключение, все результаты, описанные выше, означают, что пероральное и ректальное введение пропионата может облегчить кальцификацию сосудов, вызванную VDN, у крыс, что может происходить посредством ремоделирования кишечной микробиоты, которая увеличивает выработку SCFA, улучшает барьерную функцию кишечника и снимает воспаление.
Подавление кальцификации сосудов, вызванной VDN, и воспалительных реакций у крыс кишечной микробиотой, модулированной пропионатом Затем мы подтвердили влияние микробиоты, модулированной пропионатом, на кальцификацию сосудов у крыс, трансплантировав фекальную микробиоту крыс из контрольной группы и группы VDN + SP крысам, получавшим VDN (рис. 5a). Шесть недель спустя отложение солей кальция в аортальных артериях крыс из группы VDN + SP→VDN было, очевидно, ниже, чем в аортальных артериях крыс из группы VDN (рис. 5b).
Кроме того, количественное определение содержания кальция показало, что содержание кальция в группе VDN + SP→VDN было снижено на 16,5% (рис. 5c) по сравнению с группой VDN.
Аналогичным образом, окрашивание ализарином красным участков восходящей аорты показало резкое ингибирование отложения солей кальция в аортальных артериях крыс в группе VDN + SP→VDN (рис. 5d). Кроме того, в группе VDN + SP→VDN содержание кальция было снижено на 30,1% (рис. 5e) по сравнению с группой VDN, и наблюдалось значительное снижение концентраций TNF-α (рис. 5f), IL-1β (рис. 5g) и IL-6 (рис. 5h) в плазме. Более того, иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал ослабленную инфильтрацию макрофагов в стенку сосуда и сниженную экспрессию TNF-α (Дополнительный файл 14: Дополнительный рисунок 8a-c). По сравнению с группой VDN, концентрации TNF-α (рис. 5f), IL-1β (рис. 5g) и IL-6 (рис. 5h) в плазме были снижены в разной степени в группе контроль→VDN; однако не было никакого существенного влияния на подавление сосудистой кальцификации и воспаления в сосудистой стенке (рис. 5b–e и Дополнительный файл 14: Дополнительный рисунок 8a-c). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что кишечная микробиота, модулированная пропионатом, может облегчить индуцируемую VDN сосудистую кальцификацию у крыс и уменьшить воспаление in vivo.
Кроме того, корреляционный анализ Спирмена показал, что обилие Bifidobacterium, Muribaculaceae, Akkermansia и т. д. положительно коррелировало с уровнями SCFAs как в плазме, так и в фекалиях и отрицательно коррелировало с содержанием LPS в плазме.
Bacteroidetes, Clostridium_innocuum_group и Escherichia_Shigella имели отрицательную корреляцию с SCFAs в разной степени в плазме и фекалиях и положительную корреляцию с LPS в плазме (рис. 6f).
Кроме того, мы дополнительно измерили содержание LPS в плазме, а также концентрации ацетата, пропионата и бутирата как в плазме, так и в фекалиях. Группа контроль→VDN не показала явного снижения содержания LPS (Дополнительный файл 16: Дополнительный рисунок 9b) и явного увеличения концентрации ацетата, пропионата или бутирата (исключая бутират в фекалиях) (рис. 6g–l). В то время как группа VDN + SP→VDN показала значительное снижение содержания ЛПС (Дополнительный файл 16: Дополнительный рисунок 9b), накопление ацетата, пропионата и бутирата увеличилось (рис. 6g–l). В целом, эти результаты продемонстрировали, что кишечная микробиота, модулированная пропионатом, регулировала состав кишечной микробиоты и ее метаболизм, что приводит к потенциальному смягчению дисбактериоза, вызванного VDN. Уменьшение нарушения барьера слизистой оболочки кишечника у крыс, получавших VDN, с помощью кишечной микробиоты, модулированной пропионатом Как описано выше, гистологические характеристики толстой кишки крыс были проанализированы для изучения влияния кишечной микробиоты, модулированной пропионатом, на целостность кишечного барьера у крыс, получавших VDN.
По сравнению с крысами из группы VDN, целостность эпителия кишечника была улучшена у крыс из группы VDN + SP→VDN, включая увеличение глубины крипт (рис. 7a, b), утолщение стенки кишечника (рис. 7a, c), увеличение количества бокаловидных клеток (рис. 7a, d), повышенную экспрессию MUC2 (рис. 7a, e) и значительное снижение содержания D-лактата и диаминоксидазы (рис. 7f, g). У крыс в группе контроль→VDN не было выявлено очевидных изменений параметров кишечного барьера (рис. 7a–e) или параметров проницаемости (рис. 7f, g).
Согласно корреляционному анализу, параметры кишечного барьера (глубина крипт, толщина стенки кишечника, количество бокаловидных клеток и накопление MUC2) отрицательно коррелировали с содержанием ЛПС, но положительно коррелировали с уровнями SCFA.
Более того, D-лактат и диаминоксидаза образовали отрицательные корреляции с SCFA (рис. 7h). Подводя итог, можно сказать, что полученные результаты свидетельствуют о том, что кишечная микробиота, модулированная пропионатом, выполняет защитную функцию в барьере слизистой оболочки кишечника.
Схема механизма действия. У крыс с сосудистой кальцификацией, вызванной VDN, наблюдался дисбаланс гомеостаза кишечной микробиоты, снижение продукции SCFA, увеличение содержания LPS, нарушение целостности слизистого барьера и «протечка» кишечника, что может вызвать системные воспалительные реакции, в конечном итоге усугубляя сосудистую кальцификацию.
Добавление пропионата SCFA, трансплантация фекальной микробиоты или трансплантация Akkermansia может поддерживать баланс кишечной микробиоты, способствовать выработке SCFA и снижать уровень LPS.
Таким образом, пропионат может защищать целостность слизистого барьера, предотвращать «протечку» кишечника и подавлять воспалительные реакции, что приводит к облегчению сосудистой кальцификации